Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
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この研究は、AHA科学者開発助成金17SDG3700093(F.S.)によって支援されました。マウントシナイKL2学者賞臨床および翻訳研究キャリア開発KL2TR001435(F.S.);NIH R00 HL116645 および AHA 18TPA34170460 (C.K.

本研究では、成人ラット心筋細胞を用いた実験は、シナイ山のイカーン医科大学の認可された動物ケア・利用委員会(IACUC)プロトコルを用いて行われた。成人ラット心筋細胞は、先に説明した16.ランゲンドルフベースの方法によりスプレイグ・ドーリーラット心臓から単離された。
1. メディアの準備
<ol><li>hiPSC メディアを準備します。<ol>
<li>サプリメ?...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

ヒトiPSC-CMを実験モデルとして使用するための重要なステップは:1)一貫した性能と再現性の高い結果を保証できる高品質の心筋細胞(CM)を生成する。2)細胞が少なくとも90日間培養中に成熟し、その表現型を十分に評価することを可能にする。3)電気生理学的研究を行い、例えばカルシウム(Ca2+)過渡測定を行い、ヒトiPSC-CMの生理学的に関連する機能特性を提供する。高品質な心室状iPSC-CM?...

ヒト誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、インビトロ1、2、3、4、5、6、7、7、8で多種多様な心疾患をモデル化する魅力的なヒトベースのプラットフォームである。さらに、iPSC-CMは、新規または既存の薬剤に対する患者応答の予測、ヒット化合物のスクリーニング、および新しいパーソナライズされた薬剤9、10の開発に使用することができる。ただし、大幅な進歩にもかかわらず、iPSC-CM11を使用する場合は、いくつかの制限と課題を考慮する必要があります。その結果、心臓分化プロトコルを改善し、iPSC-CMの効率および成熟を高め、および特定の心筋細胞サブタイプ(心室、心房、および節点)を生成する方法は、強く研究され、すでにこれらのハードルを克服するための多数の培養戦略につながっている。
これらのプロトコルの堅牢性にもかかわらず、iPSC-CMの使用に関する主な懸念事項は、同じ性能と再現性を確保できる高品質の心筋細胞を得るための長くて複雑な手順の再現性です。再現性は、遺伝的背景の異なる細胞株を比較する場合だけでなく、同じ細胞株の細胞と分子比較を繰り返す場合にも重要です。iPSC密度の十分な違いのような細胞変動は、心臓分化に影響を与え、低収率および低品質の心筋細胞を生成する。これらの細胞は、CMの純粋な集団を必要としない実験を行うためにまだ使用することができ(例えば、Ca2+過渡測定を行う場合)。確かに、電気生理学的解析を行う場合、非CMは自発的にも電気刺激下でも打たないので、分析から除外するのは簡単です。しかし、品質が悪いため、iPSC-CMは、遺伝的構成によるものではない変化した電気生理学的特性(例えば、不規則なCa2+過渡性、低Ca2+振幅)を示すことができます。したがって、特にiPSC-CMを使用して心疾患をモデル化する場合、品質の悪いCMの結果と疾患表現型を混同しないことが重要です。電気生理学的研究に進む前に、慎重なスクリーニングと除外プロセスが必要です。
この方法には、高純度で高品質な心筋細胞を生成し、カルシウムおよび収縮性取得および分析システムを使用してCa2+過渡測定を行うことによってその機能を評価するための最適化されたプロトコルが含まれます。この技術は、高効率と低効率iPSC-CM製剤を区別し、ヒトiPSC-CMのより生理学的に関連する特性を提供する、シンプルでありながら強力な方法です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、カルシウム(Ca2+)の取り扱いとシグナル伝達経路の基礎科学、ならびに高スループット薬物スクリーニングおよび毒性アッセイを研究するための貴重なヒト源を提供する。ここでは、異なる細胞株間で分子的および機能的特性を一貫して再現できる高品質なiPSC-CMを生成するために使用される方法論について詳しく説明する。さらに、Ca2+処理特性の評価を通じて、その機能特性を確実に評価する方法について説明する。低酸素(O2)条件、乳酸選択、培養時間の延長は、高純度で高品質な心室様心筋細胞を産生する。孤立した成人ラット心筋細胞(ARCM)と同様に、3ヶ月齢のiPSC-CMは、より高いCa2+振幅、Ca2+再取り込み(減衰タウ)の速い速度、および30日目のiPSC-CMと比較してβアドレナリン刺激に対する陽性の潤滑反応を示す。この戦略は、技術的にシンプルで費用対効果が高く、再現可能です。それは心疾患をモデル化し、Ca2+処理タンパク質を標的とする大規模な薬物スクリーニングのための強いプラットホームを提供する。

図1に記載されたプロトコルは、培養中の時間とともに心室/成人様表現型を獲得する非常に純粋な心筋細胞を生成した。心房および心室ミオシン調節光鎖2アイソフォーム(MLC2AおよびMLC2Vそれぞれ)に対する免疫蛍光染色によって評価されたように、このプロトコルによって生成された細胞の大部分は、心臓分化の誘導後30日目にMLC2A陽性であったが、MLC2Vは同?...

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Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

ここでは、堅牢なヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を一貫して生成し、その機能を特徴付ける方法を記述し、検証する。これらの技術は、シグナル伝達経路に対する機械的洞察を開発するのに役立ち、大規模な薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供し、心臓疾患を確実にモデル化する。

カルシウム処理特性評価のための心室様HiPSC由来心筋細胞と高品質細胞製剤の生成

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

再現性は、幹細胞由来の心筋細胞を誘導する際の大きな関心事です。これらの方法を用い、iPSから高純度かつ高品質の心筋細胞を生成し、機能研究に用いることができる。この技術の主な利点は、iPSC由来の心筋細胞の精製された高品質の製剤を得るための、シンプルで信頼性の高い、費用対効果の高い、非常に強力な方法です。細胞の通過の場合、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを1ミリリットルで7〜10分間リンスしてから、PBSを1ミリリットルの経パ石培地に置き換えます。セルリフターを使用して、ウェルの底から細胞を静かに削り取り、滅菌2ミリリットルガラスピペットを使用して、切り離された細胞を機械的に解離します。顕微鏡下で見えるように細胞が小さなクラスターに持ち上げられたら、通過媒体を加えて細胞を1〜6回の比率で分割します。次に、ヒト胚性幹細胞修飾マトリックスを6つのウェルプレートから吸引する。次に、1ミリリットルの受粉培地と解約細胞1ミリリットルを各ウェルに加え、心臓分化を開始する前に70〜80%の合流に達するまで細胞を成長させます。iPSC-CMを解離する少なくとも30分前に、個々のガラスカバースリップを70%エタノールで拭き取り、カバースリップを滅菌6ウェルプレートの個々のウェルに入れます。カバースリップが乾燥したら、250〜300マイクロリットルのヒト胚幹細胞適格マトリックス溶液を各カバースリップの中央に直接加え、6つのウェルプレートを組織培養フードに入れる。代謝的に選択されたiPSC-CMを解き明かすために、35°Cで5分間の各ウェルにEDTAを含む無菌0.25%トリプシンの1ミリリットルを加え、1000マイクロリットルのピペットを使用して、単一の細胞懸濁液が達成されるまで細胞を機械的に解化する。無菌15ミリリットル円錐管で細胞を引っ張り、ウェルあたり2ミリリットルのRPMI 20培地でそれぞれをよく洗います。次に、チューブにスケーションを加え、遠心分離によって細胞をペレットします。細胞濃度の250マイクロリットル当たり3倍の10〜5番目の細胞を達成するのに十分な量の培地で細胞を再懸濁する。溶液が均質に見えるまで細胞を解化するために1000ミリリットルのピペットチップを使用してください。その後、250マイクロリットルの細胞を1000マイクロリットルのピペットチップに吸引し、溶液の全容を1つのヒト胚幹細胞修飾マトリックスコードカバースリップにゆっくりと分配する。すべての細胞を播種したら、一晩細胞培養インキュベーターにプレートを慎重に入れます。翌朝、各井戸にD7培地を2ミリリットル加えます。選択したiPSC-CMが少なくとも3ヶ月に達すると、2マイクロリットルのFura-2 AMで37°Cで10分間細胞を処理し、カルシウム分析システムに電力を供給します。アークランプを起動し、ポンプから適切な入口とコンセントにチューブを接続し、刺激装置からチャンバーに電子線を接続します。チャンバーをシステムに置きます。37°Cで流動インラインヒーターを通るProFusionチューブを37度温めたTyrodeの溶液で満たし、カメラとフレーミング開口寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。iPSC-CMをまいたガラスカバースリップをチャンバーに締め、カバースリップの上に500マイクロリットルのタイロード溶液をそっと加えます。毎分1.5ミリリットルの速度でタイロードの溶液でチャンバーを熟読し始め、電気刺激器を使用して、4ミリ秒ごとに10ボルトの1ヘルツフィールド刺激でiPC-CMを3〜5分間ペースアップします。すべての色素がチャンバーから洗い流されたら、カバースリップの左上領域に表示窓を調整し、記録を開始する。5〜10のピークの一貫したストリームを収集した後、一時停止をクリックして一時的に記録を停止し、記録を再開する前にカバースリップの反対側の端の隣接領域に顕微鏡ステージを移動します。10分間にわたってカバースリップ全体にわたってカルシウムトランシデンスをスキャンした後、メーカーの指示に従って適切な蛍光トレース分析ソフトウェアでデータを分析します。このプロトコルは、時間の経過とともに培養中の心室、成人のような表現型を取得する非常に純粋な心筋細胞を生成する。心房および心室MLC2アイソフォームに対する免疫蛍光染色法によって評価されるように、このプロトコルによって生成される細胞の大部分は、心臓分化誘導後30日目の心房MLC2アイソフォーム陽性である。心室MLC2アイソフォームは、同じ時点で多くの数で表現されています。培養時間が長くなるにつれて、MLC2アイソフォームへの完全な切り替えが観察される。これらのデータはまた、心房および心室MLC2マーカー発現細胞の割合のフロー細胞量測定法によっても確認した。カルシウム振幅は、90日目のiPSC-CMにおいて有意に増加し、成人ラットCMに対して観察されたのと同様である。非心臓細胞を汚染すると、分化中のヒトiPSC-CMの機能的成熟に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。さらに、iPSC-CMでカルシウム過渡を記録する場合、細胞が少なくとも200秒間一定の刺激下で摂氏37度で安定させ、記録を特定の時間枠に制限して再現可能な結果を確実に得る必要があります。iPSCが均質な形態を示すことを確認し、心臓分化を開始する前に細胞が70〜80%の合流度に成長することを忘れないでください。未熟なiPS由来心筋細胞の純粋な品質は、実際の表現型を反映しないが、病気の表現型と誤解される可能性がある変化した機能的特徴を示す可能性がある。したがって、純粋で高品質の心筋細胞を得ることは、一貫した再現性のある結果を提供することが重要です。

Research

JoVE Journal

Medicine

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