Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

이 연구는 AHA 과학자 개발 보조금 17SDG33700093 (F.S.)에 의해 지원되었다; 마운트 시나이 KL2 임상 및 중개 연구 경력 개발 KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 및 AHA 18TPA34170460 (C.K.).

이 연구에서 성인 쥐 심근세포를 이용한 실험은 시나이 산의 아이칸 의과 대학의 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜로 진행되었습니다. 성인 쥐 심근세포는 앞서설명한 바와같이 랑엔도르프 계 법에 의해 스프라그 다울리 쥐 하트로부터 분리되었다.
1. 미디어 준비
<ol><li>hiPSC 미디어를 준비합니다.<ol>
<li>보충제와 기저 매질을 실온(RT)으?...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

인간 iPSC-C를 실험 모델로 사용하기 위한 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 일관된 성능과 재현 가능한 결과를 보장할 수 있는 고품질 심근세포(CM)를 생성합니다. 2) 세포가 적어도 90 일 동안 배양에서 성숙하여 표현형을 적절하게 평가할 수 있도록 하는 단계; 3) 전기 생리학 연구를 수행, 예를 들어 칼슘(Ca2+) 과도 측정, 인간의 iPSC-CM의 생리학적 으로 관련된 기능적 특성을 제공하기 위해....

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)는 시험관내1, 2,3,4,5,6,7, 8에서다양한 심장 질환을 모델링하는 매력적인 인간 기반 플랫폼이다. 더욱이, iPSC-CM은 신규 또는 기존 약물에 대한 환자 반응의 예측, 히트 화합물을 스크리브하고, 새로운 맞춤형 약물을 개발하는 데 사용될 수있다 9,10. 그러나 상당한 진전이 있음에도 불구하고 iPSC-CM11을사용할 때 몇 가지 제한 사항과 과제를 고려해야 합니다. 따라서, 심장 분화 프로토콜을 개선하고, iPSC-CM의 효율및 성숙을 향상시키고, 특정 심근세포 아류형(심실, 심방 및 결절)을 생성하는 방법은 이미 이러한 장애물을 극복하기 위한 수많은 배양 전략으로 이어졌으며12,13,14,15.
이러한 프로토콜의 견고성에도 불구하고 iPSC-CM의 사용에 대한 주요 관심사는 동일한 성능과 재현 가능한 결과를 보장할 수 있는 고품질 심근세포를 얻기 위한 길고 복잡한 절차의 재현성입니다. 재현성은 세포주를 다른 유전적 배경과 비교할 때뿐만 아니라 동일한 세포주의 세포주 및 분자 비교를 반복할 때도 중요합니다. iPSCs 밀도의 잘-투-웰 차이와 같은 세포 가변성은 심장 분화에 영향을 미칩니까, 낮은 수율 및 가난한 품질의 심근세포를 생성할 수 있습니다. 이러한 셀은 여전히 CM의 순수한 모집단을 필요로 하지 않는 실험을 수행하는 데 사용될 수 있습니다(예:Ca2+ 과도 측정을 수행할 때). 실제로, 전기 생리학적 분석을 수행할 때, 비MC는 자발적으로나 전기 자극하에서도 이길 수 없으므로 분석에서 제외하기가 쉽습니다. 그러나, 가난한 품질 때문에, iPSC-CM은 그들의 유전 메이크업 때문이 아닌 변경된 전기 생리학적 특성(예를 들면, 불규칙한Ca2+ 과도, 낮은Ca2+ 진폭)을 보여줄 수 있습니다. 따라서 특히 iPSC-CM을 사용하여 심장 질환을 모델링할 때, 품질이 떨어지는 CM의 결과를 질병 표현형과 혼동하지 않는 것이 중요합니다. 전기 생리학 연구를 진행하기 전에 신중한 스크리닝 및 배제 과정이 필요합니다.
이 방법은 고순도 및 고품질 심근 세포생성및 칼슘 및 수축성 획득 및 분석 시스템을 사용하여Ca2+ 과도 측정을 수행하여 그 기능을 평가하기 위해 최적화된 프로토콜을 포함합니다. 이 기술은 간단하면서도 강력한 방법으로 고효율과 저효율 iPSC-CM 제제를 구별하고 인간 iPSC-CM의 생리학적 특성을 보다 생리적으로 관련시화합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)는칼슘(Ca2+)취급 및 신호 전달 경로뿐만 아니라 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 분석의 기초 과학을 연구하기 위한 귀중한 인간 소스를 제공합니다. 본 명세서에서, 우리는 상이한 세포주 전반에 걸쳐 분자 및 기능적 특성을 일관되게 재현할 수 있는 고품질 iPSC-CM을 생성하는 데 사용되는 방법론에 대한 상세한 설명을 제공한다. 또한Ca2+ 처리 특성의 평가를 통해 기능적 특성화를 안정적으로 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 낮은 산소(O2)조건, 젖산 선택, 그리고 배양에서 장기간 시간은 고순도 및 고품질 심실 과 같은 심근 세포를 생성합니다. 고립 된 성인 쥐 심근 세포 (ARCMs)와 유사하게, 3 개월 된 iPSC-CMS는 더 높은 Ca2 + 진폭, Ca2 + 재섭취 (부패 - 타우)의 빠른 속도 및 30 iPSC-CS에 비해 β-아드레날린 자극에 대한 긍정적 인 감수성 반응을 나타낸다. 이 전략은 기술적으로 간단하고 비용 효율적이며 재현 가능합니다. 이 제품은 심장 질환을 모델링하고 Ca2+ 취급 단백질을 대상으로 하는 대규모 약물 스크리닝을 위한 견고한 플랫폼을 제공합니다.

그림1A에 기술된 프로토콜은 배양 시간적 시간으로 심실/성인과 같은 표현형을 획득하는 고도로 순수한 심근세포를 생성했다. 심방 및 심실 미오신 조절 광계 2에 대한 면역형광 염색에 의해 평가된 바와 같이 2 개의 이소폼(MLC2A 및 MLC2V) 이 프로토콜에 의해 생성된 대부분의 세포는 심장 분화 유도 후 30일째에 MLC2A 양성이었으며, MLC2V는 동일한 시점에서 훨씬 낮?...

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Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

여기서 우리는 견고한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 일관되게 생성하고 그 기능을 특성화하는 방법을 설명하고 검증한다. 이러한 기술은 신호 경로에 대한 기계적 통찰력을 개발하고, 대규모 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하고, 심장 질환을 안정적으로 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

칼슘 취급 특성화를 위한 심실 유사 HiPSC 유래 심근세포 및 고품질 세포 제제 의 생성

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

재현성은 줄기 세포 유래 심근세포를 유도할 때 주요 관심사입니다. 이러한 방법을 사용하여 고순도 및 고품질 심근세포는 기능 연구에서 사용하기 위해 iPS에서 생성될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 iPSC 유래 심근세포의 정제되고 고품질의 제제를 얻기 위한 간단하고 신뢰할 수 있고 비용 효율적이며 매우 강력한 방법입니다.세포 패혈을 위해, PBS를 통과 배지의 1 밀리리터로 대체하기 전에 7-10 분 동안 칼슘과 마그네슘없이 PBS의 1 밀리리터로 세포를 헹구는 다. 셀 리프터를 사용하여 우물 바닥에서 세포를 부드럽게 긁어 내고 멸균 2 밀리리터 유리 파이펫을 사용하여 분리 된 세포를 기계적으로 해리시합니다. 세포가 현미경의 밑에 보이는 대로 작은 클러스터로 들어 올릴 때 1 6 비율로 세포를 분할하는 통과 매체를 추가합니다.다음으로, 인간 배아 줄기 세포자격을 갖춘 6개의 우물 플레이트에서 흡인한다. 그런 다음 통과 배지의 1 밀리리터와 각 우물에 해리 된 세포의 1 밀리리터를 추가하고 심장 분화를 시작하기 전에 70 ~ 80 %의 합류에 도달 할 때까지 세포가 성장하게하십시오. iPSC-CM을 해리하기 최소 30분 전에 개별 유리 커버 전표를 70%에탄올로 닦고 커버 슬립을 멸균 6웰 플레이트의 개별 우물에 놓습니다.커버 슬립이 건조되면, 인간 배아 줄기 세포의 250~300마이크로리터를 각 커버 슬립의 중앙에 직접 추가하고, 조직 배양 후드에 6개의 웰 플레이트를 놓는다. 대사적으로 선택된 iPSC-CM을 해리하기 위해 멸균 0.25%의 트립신을 각각 35°C에서 5분 동안 배양할 수 있도록 EDTA를 각각 양호하게 추가하고, 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 단일 셀 서스펜션이 달성될 때까지 세포를 기계적으로 해리시한다. 멸균 15 밀리리터 원컬 튜브에 세포를 당기고, 잘 당 RPMI 20 배지의 두 밀리리터로 각각 잘 씻어.그런 다음 튜브에 세체를 추가하고 원심 분리에 의해 세포를 펠릿합니다. 세포 농도의 250 마이크로리터 당 5 세포에 3 배 10을 달성하기 위해 충분한 양의 매체에서 세포를 다시 중단합니다. 1000 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 용액이 균질한 것처럼 보일 때까지 세포를 해리합니다.그런 다음 세포의 250 마이크로리터를 1000 마이크로리터 파이펫 팁으로 흡인시키고, 용액의 전체 부피를 하나의 인간 배아 줄기 세포에 천천히 분배하여 자격을 갖춘 매트릭스 코드 커버 슬립을 한다. 모든 세포가 시드되면 하룻밤 동안 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 조심스럽게 넣습니다. 다음 날 아침 마다 D7 배지 2밀리리터를 부드럽게 추가합니다.선택된 iPSC-CM이 적어도 3개월 에 도달하면 37°C에서 10분 동안 후라-2 AM의 2개의 마이크로리터로 세포를 치료하고 칼슘 분석 시스템에 전력을 공급한다. ArcLamp을 시작하고 펌프에서 적절한 입구및 콘센트 및 자극기에서 챔버에 전자 와이어에 튜브를 연결합니다. 챔버를 시스템에 배치합니다.37섭씨 37도로 유동적인 힌감 히터를 통과하는 ProFusion 튜브를 채우고 카메라를 조정하고 조리개 치수를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다. iPSC-CM으로 시드된 유리 커버 슬립을 챔버에 고정하고 500마이크로리터의 타이로드 용액을 커버 슬립 위에 직접 넣습니다. Tyrode의 용액을 분당 1.5 밀리리터로 조정하기 시작하고 전기 자극기를 사용하여 3~5분 동안 4밀리초마다 10볼트의 헤르츠 필드 자극으로 iPC-CM을 조정합니다.모든 염료가 챔버 밖으로 세척되면 표지 슬립의 왼쪽 위 부위로 보기 창을 조정하고 녹음을 시작합니다. 5~10개의 피크의 일관된 스트림을 수집한 후 일시 중지를 클릭하여 일시적으로 레코딩을 중지하고 현미경 스테이지를 커버 슬립의 반대쪽 끝에 대한 인접 영역으로 이동한 후 레코딩을 재개한다. 전체 커버 슬립을 10분 동안 동일한 방식으로 스캔한 후 제조업체의 지시에 따라 적절한 플로레시세스 추적 분석 소프트웨어로 데이터를 분석합니다.이 프로토콜은 시간이 지남에 따라 배양에서 심실, 성인과 같은 표현형을 획득하는 매우 순수한 심근세포를 생성합니다. 심방 및 심실 MLC2 등색에 대한 면역 형광 염색에 의해 평가된 바와 같이, 이 프로토콜에 의해 생성된 세포의 대부분은 심방 MLC2 이소형 양성이어서 30일째에 심장 분화의 유도 후 양성이다. 심실 MLC2 동소형은 동시에 많은 숫자로 표현됩니다.배양 시간이 증가함에 따라 MLC2 등소로의 완전한 전환이 관찰됩니다. 이들 데이터는 또한 세포를 발현하는 심방 및 심실 MLC2 마커의 백분율의 흐름 세포 측정 정량화에 의해 확인되었다. 칼슘 진폭은 성인 쥐 CM에 대해 관찰된 것과 유사한 90일째에 iPSC-CM에서 현저하게 증가합니다.비 심장 세포를 오염시키는 것은 분화 도중 인간 iPSC-CM의 기능적인 성숙에 영향을 미칠 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 또한 iPSC-CM에서 칼슘 과도를 기록할 때 세포가 섭씨 37도에서 적어도 200초 동안 일정한 자극으로 안정화되도록 하고, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 기록을 특정 시간 창으로 제한할 필요가 있다. iPSCs가 동질적인 형태를 나타내고 세포가 심장 분화를 시작하기 전에 70 ~80%의 합류로 성장할 수 있도록 하는 것을 기억하십시오.미성숙 iPS 유래 심근세포의 순수한 품질은 실제 표현형을 반영하지 않는 변경된 기능적 특성을 나타낼 수 있지만 병은 표현형으로 잘못 해석될 수 있습니다. 따라서 순수하고 고품질의 심근세포를 얻는 것은 일관되고 재현 가능한 결과를 제공하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

연구

의학

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

종양 살상 바이러스의 전 임상 평가에 대한 연구에면 쥐의 취급

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...