Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av AHA forsker Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for klinisk og translational forskning karriereutvikling KL2TR001435 (F.S.); NIH r00 HL116645 og AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Eksperimentene bruker voksen rotte cardiomyocytes i denne studien ble gjennomført med godkjent institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) protokoller av Icahn School of Medicine ved Sinai-fjellet. Den voksne rotte cardiomyocytes ble isolert fra Sprague Dawley rotte hjerter av den Langendorff-baserte metoden som tidligere beskrevet16.
1. utarbeidelse av Media
<ol><li>Klargjør hiPSC-mediet.<ol>
<li>Likevekt supplement og basal medium til romtemperatur (RT). ...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

Kritiske skritt for å bruke humant iPSC-CMs som eksperimentelle modeller er: 1) genererer høy kvalitet cardiomyocytes (CMs) som kan sikre konsistent ytelse og reproduserbar resultater; 2) slik at cellene til å modnes i kultur i minst 90 dager til tilstrekkelig vurdere sine fenotype; 3) utføre elektrofysiologisk studier, for eksempel kalsium (ca2 +) transient målinger, for å gi en fysiologisk relevant funksjonell karakterisering av menneskelig IPSC-CMs. Vi utviklet en monolag-basert differensiering metode...

Humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet cardiomyocytes (IPSC-CMs) er et attraktivt menneske-basert plattform for å modellere et stort utvalg av hjertesykdommer in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Dess, IPSC-CMs kan brukes for prediksjon av pasienten svar på romanen eller eksisterende rusmidler, til skjermen hit forbindelser, og utvikle nye personlige legemidler9,10. Imidlertid, til tross for betydelig fremgang, adskillige begrensninger og angripe nød å bli betraktet som når benytter iPSC-CMs11. Følgelig metoder for å forbedre CARDIAC differensiering protokoller, for å forbedre IPSC-CMs effektivitet og modning, og å generere spesifikke cardiomyocyte undergrupper (ventrikkel, atrieflimmer, og Nodal) har vært intenst studert og allerede ført til en rekke kultur strategier for å overvinne disse hekk12,13,14,15.
Til tross for robusthet av disse protokollene, er en stor bekymring for bruk av iPSC-CMs reproduserbarhet av lange og kompliserte prosedyrer for å oppnå høy kvalitet cardiomyocytes som kan sikre samme ytelse og reproduserbar resultater. Reproduserbarhet er ikke bare kritisk når du sammenligner cellelinjer med ulike genetiske bakgrunner, men også når du gjentar cellulære og molekylære sammenligninger av samme cellelinje. Celle variasjon, som brønn-til-brønn-forskjeller i iPSCs-tettheten, kan påvirke hjerte differensiering, generere lav ytelse og cardiomyocytes av dårlig kvalitet. Disse cellene kan fortsatt brukes til å utføre eksperimenter som ikke krever en ren befolkning av CMs (f. eks, når du utfører ca2 + transient målinger). Faktisk, når du utfører elektrofysiologisk analyse, vil ikke-CMs ikke slå, verken spontant eller under elektrisk stimulering, så det vil være lett å ekskludere dem fra analysen. Men på grunn av dårlig kvalitet, iPSC-CMs kan vise endrede elektrofysiologisk egenskaper (f. eks uregelmessig ca2 + transient, lav ca2 + amplitude) som ikke er på grunn av deres genetiske makeup. Derfor, spesielt når du bruker iPSC-CMs for å modellere hjertesykdom, er det viktig å ikke forvirre resultater fra en dårlig kvalitet CM med sykdommen fenotype. Nøye screening og eksklusjon prosesser er nødvendig før du fortsetter å elektrofysiologisk studier.
Denne metoden inkluderer optimaliserte protokoller for å generere høy renhet og høy kvalitet cardiomyocytes og for å vurdere deres funksjon ved å utføre ca2 + transient målinger ved hjelp av et kalsium-og contractility oppkjøp og analysesystem. Denne teknikken er en enkel, men likevel kraftig, måte å skille mellom høy effektivitet og lav effektivitet iPSC-CM forberedelser og gi en mer fysiologisk relevant karakterisering av menneskelig iPSC-CMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

Human indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (iPSC-CMs) gir en verdifull menneskelig kilde for å studere grunnleggende vitenskapen om kalsium (ca2 +) håndtering og signalering trasé samt høy gjennomstrømming narkotika screening og toksisitet analyser. Heri gir vi en detaljert beskrivelse av metodene som brukes til å generere høy kvalitet iPSC-CMs som kan konsekvent reprodusere molekylære og funksjonelle egenskaper på tvers av ulike cellelinjer. I tillegg er en metode beskrevet for å pålitelig vurdere deres funksjonelle karakterisering gjennom evalueringen av ca2 + håndtering egenskaper. Lav oksygen (O2) forhold, melkesyre valg, og lengre tid i kulturen produsere høy renhet og høy kvalitet ventrikkel-lignende cardiomyocytes. Analog med isolere voksen rotten cardiomyocytes (ARCMs), 3-måneden-gamle iPSC-CMs forevise høyere ca2 + amplitude, hurtigere rate av ca2 + reopptak (forråtnelse-tau), og en positiv lusitropic svaret å β-adrenerge stimulering sammenlignet med dag 30 IPSC-CMS. Strategien er teknisk enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar. Det gir en robust plattform for å modellere CARDIAC sykdom og for stor skala narkotika screening å målrette ca2 + håndtering proteiner.

Protokollen beskrevet i figur 1A genererte svært ren cardiomyocytes som erverve en ventrikkel/voksen-lignende fenotype med tid i kulturen. Som vurdert av immunofluorescence farging for atrieflimmer og ventrikkel myosin regulatoriske lys kjeden 2 isoformene (MLC2A og MLC2V, henholdsvis), de fleste av cellene som genereres av denne protokollen var MLC2A-positive på dag 30 etter induksjon av CARDIAC differensiering, mens MLC2V ble uttrykt i mye lavere beløp på samme tidspun...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Her beskriver vi og validerer en metode for å konsekvent generere robuste menneskelige indusert pluripotent stilk celle-avledet cardiomyocytes og karakterisere deres funksjon. Disse teknikkene kan hjelpe i å utvikle mekanistisk innsikt i signalering trasé, gir en plattform for stor skala narkotika screening, og pålitelig modell hjertesykdommer.

Generering av ventrikkel-lignende HiPSC-avledet Cardiomyocytes og høy kvalitet Cell forberedelser for kalsium håndtering karakterisering

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Reproduserbarhet er stor bekymring ved indusering av stamcelleavledede kardiomyocytter. Ved hjelp av disse metodene, høy renhet og høy kvalitet kardiomyocytter kan genereres fra iPS for deres bruk i funksjonelle studier. Den største fordelen med denne teknikken er at det er en enkel, pålitelig, kostnadseffektiv og ekstremt kraftig metode for å oppnå rensede preparater av høy kvalitet av iPSC-avledede kardiomyocytter.For cellepassaging, skyll cellene med en milliliter PBS uten kalsium og magnesium i syv til 10 minutter før du erstatter PBS med en milliliter passaging medium. Bruk en celleløfter til å forsiktig skrape cellene fra bunnen av brønnene, og bruk steril to milliliter glasspipette for å mekanisk dissosiere de frittliggende cellene. Når cellene har løftet inn i små klynger som synlig under mikroskopet legge passaging medium å dele cellene på en en til seks ratio.Deretter aspirerer du den menneskelige embryonale stamcellekvalifiserte matrisen fra seks brønnplaten. Deretter legger du til en milliliter passaging medium og en milliliter dissosiert celler til hver brønn, og la cellene vokse til de når 70 til 80% samløpet før du starter en hjertedividering. Minst 30 minutter før de dissosierer iPSC-CMs, tørk individuelle glassdekselslips med 70% etanol, og plasser dekselet glir inn i individuelle brønner av en steril seks brønnplate.Når dekselslippene har tørket, legg til en 250 til 300 mikroliter av human embryonal stamcellekvalifisert matriseløsning direkte på midten av hvert dekselslipp, og legg de seks brønnplatene i vevskulturhetten. For å dissosiere metabolsk valgt iPSC-CM legge til en milliliter steril 0,25% trypsin med EDTA til hver brønn i en fem minutters inkubasjon ved 35 grader celsius, og bruk en 1000 mikroliter pipette for å mekanisk dissosiere cellene til en enkelt celle suspensjon er oppnådd. Trekk cellene i sterilt 15 milliliter konisk rør, og vask hver brønn med to milliliter RPMI 20 medium per brønn.Legg deretter vaskene til røret og pellet cellene ved sentrifugering. Resuspend cellene i et tilstrekkelig volum av medium for å oppnå en tre ganger 10 til de femte cellene per 250 mikroliter celler konsentrasjon. Bruk en 1000 milliliter pipettespiss for å ta avstand fra cellene til løsningen ser ut til å være homogen.Deretter aspirerer 250 mikroliter celler inn i en 1000 mikroliter pipettespiss, og langsomt dispenser hele volumet av løsningen på en menneskelig embryonal stamcellekvalifisert matrisekodet dekselslip. Når alle cellene har blitt sådd, legg platen forsiktig inn i cellekulturinkubatoren over natten. Tilsett forsiktig to milliliter D7 medium til hver brønn neste morgen.Når de valgte iPSC-CMs nå minst tre måneder gammel behandle cellene med to mikroliter av Fura-2 AM i 10 minutter ved 37 grader Celsius, og strøm på kalsiumanalysesystemet. Start ArcLamp og koble rørene fra pumpen til riktig innløp og uttak og den elektroniske ledningen fra stimulatoren til kammeret. Plasser kammeret på systemet.Fyll ProFusion-røret som går gjennom den fluidiske inlined varmeapparatet med 37 grader Celsius varmet Tyrodes løsning, og juster kameraet og innrammingsåpningsdimensjonene for å minimere bakgrunnsområdet. Fest glassdekselet slip seeded med iPSC-CMs inn i kammeret, og forsiktig legge til 500 mikroliter av Tyrodes løsning direkte på toppen av dekselet slip. Begynn å bruke kammeret med Tyrodes løsning med en 1,5 milliliter per minutthastighet, og bruk en elektrisk stimulator til å tempo iPC-CMs med 1 Hertz feltstimulering på 10 volt hver fjerde millisekunder i tre til fem minutter.Når hele fargestoffet er vasket ut av kammeret, juster visningsvinduet til øvre venstre område av dekselet slip, og begynne opptaket. Etter å ha samlet en konsekvent strøm på fem til ti topper, klikker du pause for å midlertidig stoppe opptaket og flytte mikroskopstadiet til et tilstøtende område for motsatt ende av dekkseddelen før du gjenopptar opptaket. Etter skanning av kalsiumtransiens over hele dekselet glir på samme måte over en periode på 10 minutter analysere dataene med en passende florescence sporanalyse programvare i henhold til produsentens instruksjoner.Denne protokollen genererer svært rene kardiomyocytter som får en ventrikulær, voksen-lignende fenotype i kultur over tid. Som vurdert ved immunfluoreserende farging for atrie- og ventrikulære MLC2 isoformer, er de fleste cellene som genereres av denne protokollen atriemessige MLC2 isoformpositive på dag 30 etter induksjon av hjertediensiasjon. Mens ventrikulære MLC2 isoformer uttrykkes i mange tall samtidig.Etter hvert som tiden i kulturen øker, observeres en fullstendig overgang til MLC2 isoformene. Disse dataene ble også bekreftet ved flyt cytometrisk kvantifisering av prosentandelen av atrie- og ventrikulær MLC2-markør som uttrykker celler. Kalsiumalituden økes betydelig i iPSC-CMs på dag 90, lik den som er observert for voksne rotte-CMs.Det er viktig å merke seg at forurensende ikke-hjerteceller kan påvirke funksjonell modning av de menneskelige iPSC-CMs under differensiering. Videre, når registrere kalsiumtransienter i iPSC-CMs er det nødvendig å tillate cellene å stabilisere seg ved 37 grader Celsius under konstant stimulering i minst 200 sekunder, og for å begrense opptakene til et bestemt tidsvindu for å sikre reproduserbare resultater. Husk å bekrefte at iPSCene viser en homogen morfologi og for å tillate cellene å vokse til 70 til 80% samløpet før de initierer en hjertedilatering.Ren kvalitet i umodne iPS-avledede kardiomyocytter kan vise endrede funksjonelle egenskaper, som ikke gjenspeiler den virkelige fenotypen, men kan feiltolkes som den syke fenotypen. Derfor er det viktig å oppnå rene og høykvalitets kardiomyocytter for å gi konsistente og reproduserbare resultater.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolasjon og Funksjonell karakterisering av menneskelig Ventrikulær Cardiomyocytes fra Fresh Kirurgiske Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Håndtering av Cotton Rat i studier for de prekliniske Evaluering av Onkolytiske virus

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Høy gjennomstrømning Karakterisering av voksne stamceller Konstruert for levering av terapeutiske faktorer for nervecellene strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

En guide til å generere og bruke hiPSC Avledet NPCer for studier av nevrologiske sykdommer

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering etter en ny Disaggregering metode for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Isolering og karakterisering av et hode og hals plateepitelkarsinom undergruppe ha stamcelle Kjennetegn

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Fremstilling og<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av magnetisert mir-modifisert endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Vurdering av Sarcoplasmic retikulum kalsium Reserve og intracellulære diastolisk kalsium fjerning i isolerte ventrikulær Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...