Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Это исследование было поддержано AHA Научное развитие Грант 17SDG33700093 (F.S.); Премия ученых с ифтами kl2 в маунт-Синай за клиническое и трансляционное исследование развития карьеры KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 и AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Эксперименты с использованием взрослых кардиомиоцитов крыс в этом исследовании были проведены с утвержденными институциональных животных уход и использование комитета (IACUC) протоколов Icahn школы медицины на горе Синай. Взрослые крысы кардиомиоцитов были выделены из Sprague Dawley крысы серд...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

Критические шаги для использования человека iPSC-CMs в качестве экспериментальных моделей: 1) генерации высококачественных кардиомиоцитов (КМ), которые могут обеспечить последовательную производительность и воспроизводимые результаты; 2) позволяет клеткам созревать в культуре, по крайне...

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs) являются привлекательной человеческой основе платформы для моделирования большого разнообразия сердечных заболеваний в пробирке1,2,3,4,6,7,8. Кроме того, iPSC-CMs могут быть использованы для прогнозирования реакции пациентов на новые или существующие препараты, для проверки хит соединений, а также разработать новые персонализированные препараты9,10. Однако, несмотря на значительный прогресс, при использовании iPSC-CMs11необходимо учитывать ряд ограничений и проблем. Следовательно, методы улучшения протоколов дифференциации сердца, повышения эффективности и созревания iPSC-CMs, а также создания специфических подтипов кардиомиоцитов (желудочковые, предсердий и узлов) были интенсивно изучены и уже привели к многочисленным культурным стратегиям преодоления этих препятствий12,13,14,15.
Несмотря на надежность этих протоколов, основной проблемой для использования iPSC-CMs является воспроизводимость длительных и сложных процедур для получения высококачественных кардиомиоцитов, которые могут обеспечить такую же производительность и воспроизводимые результаты. Воспроизводимость имеет решающее значение не только при сравнении клеточных линий с различными генетическими фонами, но и при повторении клеточных и молекулярных сравнений одной и той же клеточной линии. Вариабельность клеток, такие как хорошо к колодцу различия в плотности iPSCs, может повлиять на дифференциацию сердца, генерации низкой урожайности и некачественных кардиомиоцитов. Эти клетки все еще могут быть использованы для проведения экспериментов, которые не требуют чистой популяции CMs (например, при выполнении переходных измерений Ca2'). Действительно, при выполнении электрофизиологического анализа, не-CMs не будет бить, ни спонтанно, ни под электрической стимуляции, так что будет легко исключить их из анализа. Однако, из-за низкого качества, iPSC-CMs могут показать измененные электрофизиологические характеристики (например, нерегулярные Ca2 "переходный, низкий Ca2" амплитуда), которые не из-за их генетического состава. Поэтому, особенно при использовании iPSC-CMs для моделирования сердечной болезни, важно не путать результаты некачественного СМ с фенотипом заболевания. Необходимы тщательные процессы скрининга и исключения до начала электрофизиологических исследований.
Этот метод включает в себя оптимизированные протоколы для создания высокой чистоты и высококачественных кардиомиоцитов и оценки их функции путем проведения переходных измерений Ca2 с использованием системы приобретения и анализа кальция и контрактности. Этот метод является простым, но мощным способом различать высокую эффективность и низкую эффективность подготовки iPSC-CM и обеспечить более физиологически релевантную характеристику человека iPSC-CMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs) обеспечивают ценный источник человека для изучения фундаментальной науки кальция (Ca2 ")обработки и сигнализации пути, а также высокой пропускной способностью скрининга наркотиков и токсичности анализы. В этом виде мы предоставляем подробное описание методологий, используемых для создания высококачественных iPSC-CMs, которые могут последовательно воспроизводить молекулярные и функциональные характеристики в различных клеточных линиях. Кроме того, описан метод для надежной оценки их функциональной характеристики путем оценки свойств обработки Ca2. Низкий уровень кислорода (O2) условия, выбор лактата и длительное время в культуре производят высокую чистоту и высококачественные желудочковые кардиомиоциты. Подобно изолированным взрослым крысиным кардиомиоцитам (ARCMs), 3-месячный iPSC-CMs обладают более высокой амплитудой Ca2,, более быстрой скоростью повторного отправления Ca 2 '(decay-tau), и положительной люситропной реакцией на адренергическую стимуляцию по сравнению с 30 iPSC-CMs. Стратегия технически проста, экономична и воспроизводима. Она обеспечивает надежную платформу для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний и для крупномасштабного скрининга наркотиков для целевой Ca2 "обработки белков.

Протокол, описанный на рисунке 1А, генерировал очень чистые кардиомиоциты, которые приобретают желудочковый/взрослый фенотип со временем в культуре. По оценке иммунофлуоресценции окрашивания для предсердий и желудочков миозина регулятивной световой цепи 2 из...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Здесь мы описываем и проверяем метод последовательного создания надежных антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов и характеризуют их функции. Эти методы могут помочь в развитии механистического понимания сигнальных путей, обеспечить платформу для крупномасштабного скрининга наркотиков и надежно моделировать сердечные заболевания.

Поколение вентрикулярно-как HiPSC-производные кардиомиоциты и высококачественные клеточные препараты для обработки кальция характеристика

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Воспроизводство является серьезной проблемой при индуцировании стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов. Используя эти методы, высокая чистота и высокое качество кардиомиоцитов могут быть получены из iPS для их использования в функциональных исследованиях. Основным преимуществом этой методики является простой, надежный, рентабельный и чрезвычайно мощный метод получения очищенных, высококачественных препаратов кардиомиоцитов, полученных из iPSC.Для промывки клеток, промыть клетки с одним миллилитром PBS без кальция и магния в течение семи до 10 минут, прежде чем заменить PBS с одним миллилитр прохожих среды. Используя клеточный подъемник, аккуратно соскребать клетки со дна колодцев и использовать стерильные двухми миллилитровые стеклянные пипетки, чтобы механически размежевать отдельные клетки. Когда клетки поднялись на небольшие кластеры, видимые под микроскопом, добавьте проходимую среду, чтобы разделить клетки в соотношении один-шесть.Далее, аспирировать эмбриональной стволовой клетки человека квалифицированной матрицы из шести пластины хорошо. Затем добавьте один миллилитр прохожей среды и один миллилитр диссоциированных клеток к каждой хорошо, и пусть клетки растут, пока они не достигнут 70 до 80% слияния, прежде чем начать сердечную дифференциацию. По крайней мере за 30 минут до размежевывания iPSC-CMs, протрите отдельные стеклянные крышки скользит с 70% этанола, и поместите крышку скользит в отдельных скважин стерильных шесть пластины колодца.Когда крышка скользит высохли, добавить от 250 до 300 микролитров человеческой эмбриональной стволовой клетки квалифицированного матричного раствора непосредственно на центр каждой крышки скольжения, и поместите шесть хорошо пластины в ткани культуры капот. Чтобы разобщить метаболически выбранный iPSC-CM добавить один миллилитр стерильного 0,25%трипсина с ЭДТА к каждому колодец в течение пяти минут инкубации при 35 градусах по Цельсию, и использовать 1000 микролитров пипетки механически разобщить клетки, пока одна клеточная подвеска была достигнута. Вытяните клетки в стерильной 15 миллилитров конической трубки, и мыть каждый хорошо с двумя миллилитров RPMI 20 средних на колодец.Затем добавить моет в трубку и гранулы клеток центрифугации. Повторное увеличение клеток в достаточном объеме среды для достижения в три раза 10 до пятой клетки на 250 микролитров концентрации клеток. Используйте 1000 миллилитров пипетки наконечник разобщить клетки, пока решение не окажется однородным.Затем аспирировать 250 микролитров клеток в 1000 микролитров пипетки наконечник, и медленно обойтись весь объем раствора на один эмбриональной стволовой клетки человека квалифицированных матричных закодированных крышка скольжения. Когда все клетки были посеяны, тщательно поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на ночь. Аккуратно добавив два миллилитров D7 среды для каждого хорошо на следующее утро.Когда выбранные iPSC-CMs достигают по крайней мере 3 месяцев старых обработать клетки с 2 microliters Fura-2 AM на 10 минут на 37 градусах Celsius, и сила на системе анализа кальция. Инициировать ArcLamp и подключить трубы от насоса к соответствующим вход и розетки и электронный провод от стимулятора к камере. Поместите камеру на систему.Заполните трубку ProFusion, которая проходит через жидкий inlined нагреватель с 37 градусов по Цельсию нагревается раствор Тирод, и настроить камеру и обрамление размеров диафрагмы, чтобы свести к минимуму фоновую область. Закрепите стеклянную крышку, посеянную iPSC-CMs, в камеру и аккуратно добавьте 500 микролитров раствора Tyrode прямо поверх крышки. Начните обитать камеру с раствором Tyrode на 1,5 миллилитров в минуту скорости, и использовать электрический стимулятор для темпа IPC-CMs с 1 Герц поле стимуляции на 10 вольт каждые четыре миллисекунды в течение трех-пяти минут.Когда все краситель был вымыт из камеры настроить смотровое окно в верхней левой области крышки скольжения, и начать запись. После сбора последовательного потока от пяти до 10 пиков нажмите паузу, чтобы временно остановить запись и переместить стадию микроскопа в соседнюю область для противоположного конца крышки скольжения перед возобновлением записи. После сканирования трансвестит кальция по всей крышке скольжения таким же образом в течение 10 минут анализировать данные с соответствующими флорескции трасс анализа программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя.Этот протокол генерирует очень чистые кардиомиоциты, которые приобретают желудочковый, взрослый фенотип в культуре с течением времени. По оценке иммунофлуоресцентного окрашивания для предсердий и желудочков MLC2 изоформ, большинство клеток, генерируемых этим протоколом, являются предсердием MLC2 изоформы положительные в день 30 после индукции сердечной дифференциации. В то время как желудочковые MLC2 изоформы выражаются в большом количестве в то же время точки.По мере увеличения времени в культуре наблюдается полный переход на изоформы MLC2. Эти данные были также подтверждены цитометрической количественной оценкой доли клеток маркера предсердий и желудочков MLC2. Амплитуда кальция значительно увеличивается в iPSC-CMs в день 90, подобно тому, что наблюдается для взрослых крыс CMs.Важно отметить, что загрязнение не сердечных клеток может повлиять на функциональное созревание человека iPSC-CMs во время дифференциации. Кроме того, при записи преходящих кальция в iPSC-CMs необходимо позволить клеткам стабилизироваться при 37 градусах Цельсия при постоянной стимуляции в течение по крайней мере 200 секунд, и ограничить записи определенным временным окном, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты. Не забудьте подтвердить, что iPSCs обладают однородной морфологии и позволить клеткам расти до 70 до 80% слияния до начала сердечной дифференциации.Чистое качество в незрелых кардиомиоцитах, полученных iPS, может показать измененные функциональные характеристики, которые не отражают реальный фенотип, но могут быть неправильно истолкованы как больной фенотип. Поэтому получение чистых и высококачественных кардиомиоцитов важно для обеспечения последовательных и воспроизводимых результатов.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Обращение с хлопковых крыс в исследованиях для доклинических оценки онколитических вирусов

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Высокая пропускная способность Характеристика взрослых стволовых клеток разработан для доставки терапевтических факторов для Нейропротекторное стратегий

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Выделение и характеристика головы и шеи карцинома роговых клеток субпопуляции Имея стволовой клетки Характеристики

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

подготовки и<em&gt; In Vitro</em&gt; Характеристика замагниченного MIR-модифицированная эндотелиальные клетки

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Оценка саркоплазматический ретикулум кальция резерва и внутриклеточного кальция диастолического удаления в изолированных кардиомиоцитов желудочков

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...