Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Denna forskning stöddes av AHA vetenskapsman Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award för klinisk och translationell forskarkarriär utveckling KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 och AHA 18TPA34170460 (C.K.).

De experiment som använder vuxna råtta kardiomyocyter i denna studie genomfördes med godkända institutionella djuromsorg och användning kommitté (IACUC) protokoll från Icahn School of Medicine vid berget Sinai. Den vuxna råtta kardiomyocyter isolerades från Sprague Dawley råtta hjärtan av Langendorff-baserade metoden som tidigare beskrivits16.
1. beredning av media
<ol><li>Förbered hiPSC media.<ol>
<li>Och det basala mediet till rumstemperatur (RT). Se til...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

Kritiska steg för att använda humant iPSC-CMs som experimentella modeller är: 1) generera högkvalitativa kardiomyocyter (CMs) som kan säkerställa konsekvent prestanda och reproducerbara resultat; 2) tillåta cellerna att mogna i kulturen under minst 90 dagar för att på ett adekvat sätt bedöma deras fenotyp; 3) utföra elektrofysiologiska studier, t ex kalcium (ca2 +) transienta mätningar, för att ge en fysiologiskt relevant funktionell karakterisering av humant IPSC-CMS. Vi utvecklade en monolayer-...

Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (IPSC-CMS) är en attraktiv Human-baserad plattform för att modellera en stor variation av hjärtsjukdomar in vitro-1,2,3,4,5,6,7,8. Dessutom kan IPSC-CMS användas för förutsägelse av patientens svar på nya eller befintliga läkemedel, att Screen träff föreningar, och utveckla nya personliga droger9,10. Men trots betydande framsteg, flera begränsningar och utmaningar måste övervägas när du använder iPSC-CMs11. Följaktligen, metoder för att förbättra hjärt differentiering protokoll, för att förbättra IPSC-CMS effektivitet och mognad, och för att generera specifika kardiomyocyte subtyper (ventrikulär, förmaksflimmer, och nodal) har intensivt studerats och redan lett till många kultur strategier för att övervinna dessa hinder12,13,14,15.
Oaktat robustheten hos dessa protokoll är ett stort bekymmer för användningen av iPSC-CMs reproducerbarheten av långa och komplicerade förfaranden för att erhålla högkvalitativa kardiomyocyter som kan säkerställa samma prestanda och reproducerbara resultat. Reproducerbarhet är kritisk inte bara när man jämför cellinjer med olika genetiska bakgrunder, men också när man upprepar cellulära och molekylära jämförelser av samma cell linje. Cell variation, såsom väl till väl skillnader i iPSCs densitet, kan påverka hjärt differentiering, genererar en låg avkastning och dålig kvalitet kardiomyocyter. Dessa celler kan fortfarande användas för att utföra experiment som inte kräver en ren population av CMs (t. ex. vid utförande av ca2 + transienta mätningar). Faktum är att när du utför elektrofysiologiska analys, icke-CMs kommer inte att slå, varken spontant eller under elektrisk stimulering, så det kommer att bli lätt att utesluta dem från analysen. Men på grund av dålig kvalitet, iPSC-CMs kan visa förändrade elektrofysiologiska egenskaper (t. ex., oregelbunden ca2 + övergående, låg ca2 + amplitud) som inte beror på deras genetiska makeup. Därför, särskilt när du använder iPSC-CMs för att modellera hjärtsjukdom, det är viktigt att inte förväxla resultat från en dålig kvalitet CM med sjukdomen fenotyp. Noggranna screening-och uteslutnings processer krävs innan man går vidare till elektrofysiologiska studier.
Denna metod innehåller optimerade protokoll för att generera hög renhet och högkvalitativa kardiomyocyter och för att bedöma deras funktion genom att utföra ca2 + transienta mätningar med hjälp av ett kalcium och kontraktilitet förvärvs-och analyssystem. Denna teknik är en enkel, men ändå kraftfull, sätt att skilja mellan hög verkningsgrad och låg verkningsgrad iPSC-CM preparat och ge en mer fysiologiskt relevant karakterisering av mänskliga iPSC-CMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) ger en värdefull mänsklig källa för att studera den grundläggande vetenskapen om kalcium (ca2 +) hantering och signalering vägar samt hög genomströmning Drug screening och toxicitetsanalyser. Häri ger vi en detaljerad beskrivning av de metoder som används för att generera högkvalitativa iPSC-CMs som konsekvent kan reproducera molekylära och funktionella egenskaper mellan olika cellinjer. Dessutom beskrivs en metod för att tillförlitligt bedöma deras funktionella karaktärisering genom utvärderingen av ca2 + hanteringsegenskaper. Låg syre (O2) villkor, laktat urval, och långvarig tid i kulturen producera hög renhet och högkvalitativa ventrikulär-liknande kardiomyocyter. Liknar isolerade vuxna råtta kardiomyocyter (ARCMs), 3-månaders-gamla iPSC-CMs uppvisar högre ca2 + amplitud, snabbare ca2 + återupptaget (Decay-Tau), och en positiv lusitropic svar på β-adrenerga stimulering jämfört med dag 30 IPSC-CMS. Strategin är tekniskt enkel, kostnadseffektiv och reproducerbar. Det ger en robust plattform för att modellera hjärtsjukdom och för storskalig läkemedels screening för att rikta ca2 + hantera proteiner.

Protokollet som beskrivs i figur 1A genererade mycket ren kardiomyocyter som förvärvar en ventrikulär/vuxen-liknande fenotyp med tid i kulturen. Enligt bedömning av immunofluorescensfärgning för förmaks-och ventrikulär myosin-regulatoriska ljus kedjan 2 ISO Forms (MLC2A respektive MLC2V), var majoriteten av de celler som genereras av detta protokoll MLC2A-positiva vid dag 30 efter induktion av hjärt differentiering, medan MLC2V uttrycktes i mycket lägre mängder vi...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Här beskriver och validerar vi en metod för att konsekvent generera robusta humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter och karakterisera deras funktion. Dessa tekniker kan bidra till att utveckla mekanistisk insikt i signalering vägar, ge en plattform för storskalig Drug screening, och tillförlitligt modell hjärtsjukdomar.

Generering av ventrikulär-liknande HiPSC-härledda Kardiomyocyter och högkvalitativa cell preparat för kalcium hantering karakterisering

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Reproducerbarhet är ett stort bekymmer när inducera stamceller-härledda kardiomyocyter. Med hjälp av dessa metoder, hög renhet och hög kvalitet kardiomyocyter kan genereras från iPS för deras användning i funktionella studier. Den största fördelen med denna teknik är som är en enkel, tillförlitlig, kostnadseffektiv, och extremt kraftfull metod för att erhålla renas, högkvalitativa preparat av iPSC-härledda kardiomyocyter.För cellpassning, skölj cellerna med en milliliter PBS utan kalcium och magnesium i sju till tio minuter innan PBS ersätts med en milliliter passaging medium. Med hjälp av en celllyftare skrapar du försiktigt cellerna från brunnarnas botten och använder sterila två milliliter glaspipett för att mekaniskt ta isär de fristående cellerna. När cellerna har lyfts in i små kluster som syns under mikroskopet lägga passaging medium för att dela cellerna på en till sex förhållande.Därefter aspirera den mänskliga embryonala stamceller kvalificerade matris från de sex väl plattan. Tillsätt sedan en milliliter passaging medium och en milliliter av dissocierade celler till varje brunn, och låt cellerna växa tills de når 70 till 80%confluency innan du startar en hjärtdifferentiering. Minst 30 minuter innan iPSC-CMs separeras, torka enskilda glaslock glider med 70%etanol, och placera locket glider in i enskilda brunnar av en steril sex brunnsplatta.När locket glider har torkat, tillsätt en 250 till 300 mikroliter av mänskliga embryonala stamceller kvalificerad matrislösning direkt på mitten av varje täcka slip, och placera de sex väl plattan i vävnadskulturen huva. För att separera den metaboliskt valda iPSC-CM lägga till en milliliter av steril 0,25%trypsin med EDTA till varje brunn för en fem minuters inkubation vid 35 grader celsius, och använda en 1000 mikroliterpipett för att mekaniskt ta isär cellerna tills en enda cell suspension har uppnåtts. Dra cellerna i sterila 15 milliliter koniska röret, och tvätta varje brunn med två milliliter RPMI 20 medium per brunn.Tillsätt sedan tvättar till röret och pellet cellerna genom centrifugeringen. Resuspend cellerna i en tillräcklig volym av medium för att uppnå en tre gånger 10 till de femte cellerna per 250 mikroliter av celler koncentration. Använd en pipettspets på 1000 milliliter för att separera cellerna tills lösningen verkar vara homogen.Sedan aspirera 250 mikroliter celler i en 1000 microliter pipett spets, och långsamt dispensera hela volymen av lösningen på en mänsklig embryonala stamceller kvalificerad matris kodade täcka slip. När alla celler har sådd, försiktigt placera plattan i cellkulturen inkubator över natten. Tillsätt försiktigt två milliliter D7 medium till varje brunn nästa morgon.När de valda iPSC-CMs nå minst tre månader gamla behandla cellerna med två mikroliter av Fura-2 AM i 10 minuter vid 37 grader Celsius, och makt på kalcium analyssystemet. Påbörja ArcLamp och anslut rören från pumpen till lämpligt inlopp och utlopp och den elektroniska ledningen från stimulatorn till kammaren. Placera kammaren på systemet.Fyll ProFusion-röret som går genom fluidic inlined värmare med 37 grader Celsius värmde Tyrode lösning, och justera kameran och inramning bländare dimensioner för att minimera bakgrundsområdet. Fäst glaskåpan slip seedade med iPSC-CMs i kammaren, och försiktigt lägga 500 mikroliter av Tyrode lösning direkt ovanpå locket slip. Börja profusing kammaren med Tyrode lösning på en 1,5 milliliter per minut ränta, och använda en elektrisk stimulator att takten iPC-CMs med 1 Hertz fältstimulering på 10 volt var fjärde millisekunder i tre till fem minuter.När alla färgämnet har tvättats ut ur kammaren justera visningsfönstret till den övre vänstra regionen av locket, och börja inspelningen. Efter att ha samlat en konsekvent ström av fem till 10 toppar klicka paus för att tillfälligt stoppa inspelningen och flytta mikroskopet scenen till ett angränsande område för den motsatta änden av luckan innan återuppta inspelningen. Efter skanning av kalciumtransience över hela locket glida på samma sätt under en period av 10 minuter analysera data med en lämplig florescence spårningsanalys programvara enligt tillverkarens instruktioner.Detta protokoll genererar mycket rena kardiomyocyter som förvärvar en ventrikulär, vuxen-liknande fenotyp i kultur över tiden. Som bedömts av immuno fluorescerande färgning för förmaks- och ventrikulära MLC2 isoforms, majoriteten av cellerna som genereras av detta protokoll är förmaksflalystnaDSpositiv vid dag 30 efter induktion av hjärt differentiering. Medan ventrikulära MLC2 isoformer uttrycks i mycket siffror vid samma tidpunkt punkt.När tiden i kulturen ökar, observeras en komplett övergång till MLC2-isoformerna. Dessa uppgifter bekräftades också av flöde cytometric kvantifiering av andelen förmaks- och ventrikulärt MLC2 markör uttrycka celler. Kalciumamplituden ökas signifikant i iPSC- CMs vid dag 90, liknande den som observerats för vuxna rat-ING: er.Det är viktigt att notera att förorena icke-hjärt celler kan påverka den funktionella mognaden av den mänskliga iPSC-CMs under differentiering. Vidare, när spela in kalcium transienter i iPSC-CMs det är nödvändigt att låta cellerna att stabiliseras vid 37 grader Celsius under konstant stimulering i minst 200 sekunder, och att begränsa inspelningarna till en viss tidsfönster för att säkerställa reproducerbara resultat. Kom ihåg att bekräfta att iPSCs uppvisar en homogen morfologi och att låta cellerna växa till 70 till 80%confluency innan du påbörjar en hjärt differentiering.Ren kvalitet i omogna iPS-härledda kardiomyocyter kan visa förändrade funktionella egenskaper, som inte återspeglar den verkliga fenotyp, men kan misstolkas som den sjuka fenotyp. Därför är erhålla ren och hög kvalitet kardiomyocyter viktigt att ge konsekvent och reproducerbara resultat.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Hantering av Cotton Rat i studier för Preklinisk utvärdering av onkolytisk virus

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Hög genomströmning karakterisering av vuxna stamceller Engineered för leverans av terapeutiska faktorer för Nervskyddande Strategier

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

En guide till Generera och använda hiPSC Härledda NPCs för studien av Neurologiska sjukdomar

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Characterization efter en ny Disaggregation metod för Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Isolering och karakterisering av en huvud- och hals skivepitelcancer subpopulation med stamcells Egenskaper

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

framställning och<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Bedömning av sarkoplasmatiska nätmagen kalcium reserv och intracellulära diastoliskt kalcium borttagning i isolerade ventrikulära hjärtmuskelcellerna

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...