Name: generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Bu araştırma AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) tarafından desteklenmiştir; Mount Sinai KL2 Bilim Adamları Klinik ve Çevirisel Araştırma Kariyer Geliştirme KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ve AHA 18TPA34170460 (K.K.).

Bu çalışmada erişkin sıçan kardiyomiyositleri kullanılarak yapılan deneyler, Mount Sinai'deki Icahn Tıp Fakültesi'nin onaylı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolleri ile gerçekleştirilmiştir. Erişkin sıçan kardiyomiyositler daha önce açıklandığı gibi Langendorff tabanlı yöntem ile Sprague Dawley sıçan kalplerinden izole edildi16.
1. Medyanın Hazırlanması
<ol><li>HiPSC ortamını hazırlayın.<ol>
<li>Ek ve bazal o...

<ol>
	<li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy.">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955 (2015).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li><li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease.">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li><li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation.">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li><li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li><li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery.">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li><li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery.">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li><li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications.">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li><li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).</li><li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic,+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro.">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation.">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+fetal+heart+development.">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes.">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes.">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li><li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li><li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories.">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li><li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes.">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).</li><li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation.">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li></ol>

Deneysel modeller olarak insan iPSC-CMs kullanmak için kritik adımlar şunlardır: 1) tutarlı performans ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabilir yüksek kaliteli kardiyomiyositler (CMs) üreten; 2) hücrelerin en az 90 gün boyunca kültür içinde olgunlaşmasına izin vererek fenotiplerini yeterince değerlendirmek; 3) insan iPSC-CM'lerinin fizyolojik olarak ilgili fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamak için kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümler gibi elektrofizyolojik çalışmalar yapmak. Yüksek kal...

İnsan indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) in vitro1,2,3,4,5,6,7,8kalp hastalıklarının büyük bir çeşitlilik modellemek için çekici bir insan tabanlı platformvardır. Ayrıca, iPSC-CMs yeni veya mevcut ilaçlara hasta yanıtlarının tahmin için kullanılabilir, vurmak bileşikleri ekrana, ve yeni kişiselleştirilmiş ilaçlar geliştirmek9,10. Ancak, önemli ilerleme rağmen, çeşitli sınırlamalar ve zorluklar iPSC-CMs11kullanırken dikkate alınması gerekir. Sonuç olarak, yöntemleri kardiyak farklılaşma protokolleri geliştirmek için, iPSC-CMs verimliliği ve olgunlaşma geliştirmek için, ve spesifik kardiyomiyosit alt türleri oluşturmak için (ventriküler, atriyal, ve nodal) yoğun olarak incelenmiş ve zaten bu engelleri aşmak için çok sayıda kültür stratejileri yol açtı12,13,14,15.
Bu protokollerin sağlamlığına rağmen, iPSC-CM'lerin kullanımı için önemli bir endişe, aynı performansı ve tekrarlanabilir sonuçları sağlayabilen yüksek kaliteli kardiyomiyositler elde etmek için uzun ve karmaşık prosedürlerin tekrarlanabilirliğidir. Tekrarlanabilirlik sadece farklı genetik arka planlar ile hücre hatları karşılaştırırken değil, aynı zamanda aynı hücre hattının hücresel ve moleküler karşılaştırmalar tekrarlanırken önemlidir. Hücre değişkenliği, örneğin iPSCs yoğunluğundaki iyi-iyi farklılıklar, kardiyak farklılaşmayı etkileyerek düşük verim ve düşük kaliteli kardiyomiyositler üretebilir. Bu hücreler hala saf cm popülasyonu gerektirmeyen deneyler yapmak için kullanılabilir (örneğin, Ca2+ geçici ölçümler icra ederken). Gerçekten de, elektrofizyolojik analiz yaparken, olmayan CM'ler ne kendiliğinden ne de elektriksel stimülasyon altında yenmez, bu nedenle onları analizden dışlamak kolay olacaktır. Ancak, kalitesiz olması nedeniyle, iPSC-CM'ler genetik yapısına bağlı olmayan değiştirilmiş elektrofizyolojik özellikleri (örneğin, düzensiz Ca2+ geçici, düşük Ca2+ genliği) gösterebilirler. Bu nedenle, özellikle kalp hastalığı modellemek için iPSC-CMs kullanırken, hastalık fenotip ile düşük kaliteli CM sonuçları karıştırmak için önemlidir. Elektrofizyolojik çalışmalara devam edilmeden önce dikkatli tarama ve dışlama işlemleri gereklidir.
Bu yöntem, yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli kardiyomiyositler üretmek ve kalsiyum ve kontraktillik edinimi ve analiz sistemi kullanarak Ca2+ geçici ölçümler yaparak işlevlerini değerlendirmek için optimize edilmiş protokolleri içerir. Bu teknik, yüksek verimlilik ve düşük verimli iPSC-CM preparatları ayırt etmek ve insan iPSC-CM'lerin fizyolojik olarak daha alakalı bir karakterizasyonu sağlamak için basit, ama güçlü bir yoldur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27(-) insulin Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A18956-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic inline heater</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>IL-H-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC-qualified matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hPSC media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33493-01</td>
			<td>StemFlex Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR-1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>EC-B25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myocyte calcium and contractility system</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>ISW-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>10906-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>124-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magensium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Glass Cover Slips</td>
			<td>Lab Scientific</td>
			<td>7807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11879-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A33492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s solution</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BSS-355w</td>
			<td>Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of ventricular-like hipsc-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kalsiyum temel bilim (Ca2 +) işleme ve sinyal yollarının yanı sıra yüksek iş gücü ilaç tarama ve toksisite tahlilleri eğitimi için değerli bir insan kaynağı sağlar. Burada, farklı hücre hatlarında moleküler ve işlevsel özellikleri sürekli olarak üretebilen yüksek kaliteli iPSC-CM'ler üretmek için kullanılan metodolojilerin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Ayrıca, Ca2+ işleme özelliklerinin değerlendirilmesi yoluyla işlevsel karakterizasyonlarını güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem tanımlanır. Düşük oksijen (O2)koşulları, laktat seçimi ve kültürde uzun süreli yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli ventriküler benzeri kardiyomiyositler üretir. İzole yetişkin sıçan kardiyomiyositlerine (ARCM) benzer şekilde, 3 aylık iPSC-CM'ler daha yüksek Ca2+ genlik, daha hızlı Ca2+ geri alım oranı (bozunma-tau) ve 30 gün iPSC-CM'lere göre β-adrenerjik stimülasyona pozitif lusitropik yanıt sergiler. Strateji teknik olarak basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir. Bu kardiyak hastalığı modellemek için sağlam bir platform sağlar ve büyük ölçekli ilaç tarama hedef Ca2 + işleme proteinleri.

Şekil 1 A'da açıklanan protokol, kültürde zamanla ventrikül/yetişkin benzeri fenotip elde eden son derece saf kardiyomiyositler üretmiştir. Atriyal ve ventriküler miyozin düzenleyici ışık zinciri 2 izoform (MLC2A ve MLC2V, sırasıyla) için immünoforesans boyama ile değerlendirildiği gibi, bu protokol tarafından oluşturulan hücrelerin çoğunluğu MLC2A-pozitif gün 30 kardiyak farklılaşma indüksiyonsonra, MLC2V aynı anda çok daha düşük miktarlar...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization at JoVE.com

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler indüklenirken tekrarlanabilirlik önemli bir sorundur. Bu yöntemler kullanılarak, fonksiyonel çalışmalarda kullanılmak üzere iPS'den yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli kardiyomiyositler üretilebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin saflaştırılmış, yüksek kaliteli preparatlarını elde etmek için basit, güvenilir, uygun maliyetli ve son derece güçlü bir yöntem olmasıdır.Hücre geçişi için, bir mililitre lik bir mililitre lik orta ile PBS'yi değiştirmeden önce hücreleri kalsiyum ve magnezyum suz bir mililitre ile 7 ila 10 dakika durulayın. Bir hücre kaldırıcı kullanarak, yavaşça kuyuların altından hücreleri kazıyın ve mekanik müstakil hücreleri ayrıştırmak için steril iki mililitre cam pipet kullanın. Hücreler mikroskop altında görünür olarak küçük kümeler halinde kaldırdı zaman bir ila altı oranında hücreleri bölmek için geçiş ortamı ekleyin.Sonra, altı kuyu plaka insan embriyonik kök hücre nitelikli matris aspire. Sonra her kuyuya bir mililitre passaging ortamı ve bir mililitre ayrıştırılmış hücre ekleyin ve hücrelerin kardiyak farklılaşmaya başlamadan önce %70 ila %80'lik biraraya gelene kadar büyümesine izin verin. iPSC-CM'leri ayırmadan en az 30 dakika önce, tek tek cam kapak fişlerini %70 etanol ile silin ve kapak fişlerini steril altı kuyu plakasının tek tek kuyularına yerleştirin.Kapak fişleri kuruduğunda, 250 ila 300 mikrolitre insan embriyonik kök hücre nitelikli matris çözeltisini doğrudan her kapak fişinin ortasına ekleyin ve altı kuyu plakasını doku kültürüne yerleştirin. Metabolik olarak seçilmiş iPSC-CM ayırmak için 35 santigrat derece beş dakikalık kuluçka için her kuyuya EDTA ile steril 0.25% tripsin bir mililitre eklemek ve mekanik tek bir hücre süspansiyon elde edilene kadar hücreleri ayırmak için 1000 mikrolitre pipet kullanın. Steril 15 mililitrekonik tüp hücreleri çekin ve iyi başına RPMI 20 orta iki mililitre ile her iyi yıkayın.Daha sonra tüpe yıkıntıları ekleyin ve santrifüj ile hücreleri pelet. Hücrelerin konsantrasyonu 250 mikrolitre başına beş hücre üç kez 10 elde etmek için orta yeterli hacimde hücreleri yeniden askıya. Çözelti homojen görünene kadar hücreleri ayrıştırmak için 1000 mililitrelik pipet ucu kullanın.Daha sonra 1000 mikrolitrelik pipet ucuna 250 mikrolitre hücre aspire edin ve çözeltinin tüm hacmini yavaş yavaş bir insan embriyonik kök hücresi nitelikli matris kodlu kapak fişine dağıtın. Tüm hücreler tohumlanmış zaman, dikkatle hücre kültürü kuluçka içine bir gecede plaka yerleştirin. Yavaşça her iyi ertesi sabah için D7 orta iki mililitre ekleyerek.Seçilen iPSC-CM'ler en az üç aylık olduğunda hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca iki mikrolitre Fura-2 ile tedavi edin ve kalsiyum analiz sistemindegüç kullanın. ArcLamp başlatın ve uygun giriş ve çıkışları ve odaya uyarıcı gelen elektronik tel pompa tüpleri bağlayın. Odayı sisteme yerleştirin.37 santigrat derece ile akışkan inlined ısıtıcı ile çalışan ProFusion tüp doldurun Tyrode's çözüm ısıtTı, ve arka plan alanı en aza indirmek için kamera ve çerçeveleme diyafram boyutları ayarlayın. IPSC-CM'lerle tohumlanmış cam kapağı nı odaya sabitle ve Tyrode'un çözeltisinin 500 mikrolitresini doğrudan kapak fişinin üzerine ekleyin. Dakikada 1,5 mililitre hızında Tyrode's çözeltisi ile oda profusing başlayın ve üç ila beş dakika boyunca her dört milisaniyede 10 volt 1 Hertz alan stimülasyon ile iPC-CMs hızı için bir elektrik uyarıcı kullanın.Boyanın tamamı odadan yıkandığında, görüntüleme penceresini kapak fişinin sol üst bölgesine ayarlayın ve kaydı başlatın. Beş ila 10 tepeden oluşan tutarlı bir akış topladıktan sonra kaydı geçici olarak durdurmak için duraklatma'yı tıklatın ve kaydı devam ettirmeden önce kapağın diğer ucu için mikroskop aşamasını bitişik bir alana taşıyın. 10 dakikalık bir süre boyunca tüm kapak kayma boyunca kalsiyum geçiciliği tarandıktan sonra üreticinin talimatlarına uygun uygun floresan izleme analiz yazılımı ile verileri analiz edin.Bu protokol, zaman içinde kültürde ventriküler, yetişkin benzeri bir fenotip elde eden son derece saf kardiyomiyositler üretir. Atriyal ve ventrikül MLC2 izoformları için immünüplin floresan boyama ile değerlendirildiği gibi, bu protokol tarafından oluşturulan hücrelerin çoğunluğu kardiyak farklılaşmain indüksiyonundan sonra 30. Ventriküler MLC2 izoformları aynı anda çok sayıda ifade edilir iken.Kültürde zaman arttıkça MLC2 izoformlarına tam bir geçiş gözlenir. Bu veriler aynı zamanda atriyal ve ventriküler MLC2 belirteç hücrelerinin yüzdesinin akış sitometrik niceliği ile de doğrulandı. Kalsiyum genliği önemli ölçüde iPSC-CMs gün 90, yetişkin sıçan CMs için gözlenen benzer artar.Kardiyak olmayan hücrelerin kontamine edilmesinin farklılaşma sırasında insan iPSC-CM'lerinin fonksiyonel olgunlaşmasını etkileyebileceğini unutmayın. Ayrıca, iPSC-CM'lerde kalsiyum geçicilerini kaydettirdiğinizde, hücrelerin en az 200 saniye boyunca sabit uyarılma altında 37 derecede stabilize olmasına izin vermek ve kayıtları tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için belirli bir zaman penceresiyle sınırlamak gerekir. IPSC'lerin homojen bir morfoloji sergilediğini ve hücrelerin kardiyak farklılaşmayı başlatmadan önce %70 ila %80'e kadar büyümesine izin vermeyi unutmayın.Olgunlaşmamış iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde saf kalite, gerçek fenotipi yansıtmayan, ancak hastalıklı fenotip olarak yanlış yorumlanabilecek değiştirilmiş fonksiyonel özellikler gösterebilir. Bu nedenle, saf ve yüksek kaliteli kardiyomiyosit elde tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için önemlidir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...