Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues at JoVE.com

نشكر أخصائيي المختبرات وأخصائيي الأوبئة والشركات التابعة لإدارات الصحة العامة على تقديم عينات إلى مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي النتائج والاستنتاجات التي توصل إليها المؤلفون ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي لمراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. استخدام الأسماء التجارية والمصادر التجارية هي لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة من قبل مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها.

وفي حين أن بروتوكول IHC قد تم تنفيذه على الأنسجة الثابتة بالفورملين، والتي تبطل RABV إذا كانت موجودة، ينبغي اتباع بروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة بشكل صحيح. جميع إجراءات السلامة البيولوجية موصوفة في السلامة الحيوية في المختبرات الميكروبيولوجية والطب الحيوي (BMBL) الطبعة الخامسة (https://w...

<ol>
	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus:+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles.">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consulation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).</li><li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens.">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li><li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+five+year+(1985-1989)+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies.">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues.">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections.">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li><li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies+prevention--United+States,+2008:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices.">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).</li><li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test.">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses.">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li></ol>

نظرا لارتفاع معدل الوفيات الناجمة عن داء الكلب بعد ظهور الأعراض ، فإن تشخيص الحيوانات المشتبه بها لعدوى RABV أمر بالغ الأهمية لعلاج وقائي مناسب بعد التعرض. يعتمد تشخيص داء الكلب في المقام الأول على تقنيات DFA و DRIT و PCR باستخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة. لاختبار الأنسجة المثبتة بالفورمولين، ...

داء الكلب هو التهاب الدماغ التدريجي الحاد الناجم عن الشعور السلبي فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتمي إلى جنس lyssavirus1. ما يقرب من 99٪ من جميع الوفيات البشرية الناجمة عن العدوى بفيروس داء الكلب (RABV)، وهو نوع عضو من جنس، وينتقل عن طريق ال2. داء الكلب تشخيص الحيوانات المشتبه به يعتمد على الكشف عن مستضد (في المقام الأول الفيروسية المشفرة نيوكليوبروتين, N البروتين) في مجمع مع الحمض النووي الريبي الجينومي (ريبونوكليوبروتين المعقدة, RNP) في أنسجة الدماغ3. يعتبر الكشف عن المستضد من خلال اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب4. تستخدم الطريقة مواد الدماغ المجمدة الطازجة أو الطازجة ، وانطباع اللمس على الشريحة ، والتثبيت في الأسيتون ، والتلطيخ باستخدام الأيزوثيوسيانات الفلورية المتاحة تجاريا (FITC) المسماة الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة (mAbs / pAbs) وقراءتها من قبل المجهر الفلوري5. اختبار DFA سريع وحساس ومحدد للكشف عن مستضد داء الكلب في أنسجة الدماغ الطازجة. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات اختبار كيميائي مناعي سريع مباشر (DRIT) ، تقنية الكيمياء المناعية المعدلة (IHC) ، لإظهارحساسيةمماثلة ل DFA ولكنه يوفر ميزة المجهر الخفيف للتصور 6 . في حين أن طريقة الكشف المستخدمة في DRIT ، تشبه IHC ، فإن الخطوة الأولية تستخدم الأنسجة الطازجة أو المجمدة لتوليد انطباعات لمسة عن العينة تليها التثبيت في الفورملين.
IHC هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد التغيرات النسيجية والكشف عن البروتينات باستخدام أجسام مضادة محددة في الأنسجة الثابتة الفورماتين جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين. IHC هو اختبار بديل راسخ للكشف عن مستضد داء الكلب في أقسام الأنسجة7. وقد استخدمت بشكل خاص IHC لتشخيص الحالات بأثر رجعي التي أظهرت الأمراض العصبية لتحديد عبء داء الكلب8. البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الفورملين الثابتة الحفاظ على البروتينات للكشف حتى بعد عدة سنوات عند تخزينها في درجة الحرارة المحيطة9. علاج الفورمالين يعدل البروتينات عن طريق ربط وتغيير سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية، والتي قد تجعل epitopes لم يعد رد الفعل ضد الأجسام المضادة10. في حين أن اختبار IHC للكشف عن مستضد داء الكلب ينطوي إما على mAbs أو pAbs ، فإن هذا الأخير مفيد حيث يمكن اكتشاف العديد من الأسطح وفيروسات أليسا المتباينة11.
الخطوات القياسية التي ينطوي عليها IHC هي تثبيت الأنسجة ، وتضمينها في كتل البارافين ، وتقسيم الأنسجة ، وإزالة البارافينين والترطيب ، واستعادة الظهارة ، والتفاعل ضد الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والتطوير باستخدام الركائز الكروموجينية. تصف هذه المخطوطة وصفا مفصلا لبروتوكول تشخيص داء الكلب. للكشف عن مستضد داء الكلب، يتم استخدام مصل الفأر المحصن ب RABV (pAbs) المتولد في المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) أتلانتا، جورجيا، بالاشتراك مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرة ذات المستويات الحيوية. يتم الكشف عن القيمة المطلقة البيوتينية بإضافة مركب البيروكسيديز (HRP) من البكتيريا العقدية الفجلية (HRP) تليها تطور اللون مع ركيزة أمينية إيثيلكاربازول.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

واحدة من الطرائق التشخيصية الأولية لداء الكلب هو الكشف عن الريبونوكليوبروتين الفيروسي (RNP) مجمع (مستضد) في عينات الأنسجة المصابة. في حين أن اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) أو الاختبار المناعي السريع المباشر (DRIT) يستخدمان بشكل شائع للكشف عن المستضد ، فإن كلا الاختبارين يتطلبان أنسجة طازجة و / أو مجمدة للانطباعات على الشرائح قبل الكشف عن المستضد باستخدام الأجسام المضادة. إذا تم جمع العينات وإصلاحها في الفورمالين، لا يكون أي من الاختبارين الأمثل للكشف عن المستضد، ومع ذلك، يمكن إجراء الاختبار عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية (IHC) بعد تضمينها في كتل البارافين والقسم. مع هذه الطريقة IHC ، تلطخ الأنسجة بالأجسام المضادة لداء الكلب ، ويتم إزالة الأقسام ، واسترجاع المستضد عن طريق انحلال جزئي أو طرق أخرى ، واحتضانها بأجسام مضادة أولية وثانوية. وتلطخ المستضدات باستخدام الفجل peroxidase / الأمينية إيثيل كاربازول ومضادة ملطخة hematoxylin للتصور باستخدام المجهر الخفيف. بالإضافة إلى الكشف عن مستضد محددة، تثبيت الفورمالين يقدم مزايا أخرى مثل تحديد التغيرات النسيجية، وظروف استرخاء لتخزين العينات والنقل (تحت درجات الحرارة المحيطة)، والقدرة على اختبار الحالات بأثر رجعي وتحسين السلامة البيولوجية من خلال تعطيل العوامل المعدية.

يوضح الشكل 2 نتائج تلطيخ IHC التمثيلية لعينات التحكم الإيجابية والسلبية في أنسجة الدماغ المختلفة التي تم اختبارها. ويمثل الشكل 2A,D,G عينات موجبة عند 200x، بينما يتوافق الشكل 2B,E,H مع التكبير 400x على التوالي. <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues at JoVE.com

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

هنا، نقدم بروتوكول اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب كاختبار تشخيصي بديل للأنسجة الثابتة بالفورمالين.

اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس ليسا من الأنسجة الثابتة الفورمالين

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

يتم إصلاح الأنسجة المستخدمة في الكيمياء المناعية وعلم الأنسجة النسيجي التشخيصي بشكل روتيني في 10٪ من الفورمالين العازل للفوسفات. الكشف عن مستضد فيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم إصلاحها في الفورماتين يمثل تحديا فريدا من نوعه، وقد وجد أن اختبار IHC هو طريقة حساسة ومحددة للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب. الميزة الأساسية للخزعة أو طرق الكشف الأخرى هي أنه يمكن اكتشاف المستضدات فيما يتعلق بالأنسجة ومورفولوجيا الخلايا.مع IHC، توطين مستضد داء الكلب في الدماغ والأنسجة غير المخية، وتوفير معلومات إضافية التي لا يمكن الحصول عليها من خلال أقسام روتينية Hematoxylin وEosin وصمة عار. اختبار تشخيص داء الكلب مهم لبدء الوقاية بعد التعرض في البشر المعرضين لفيروس داء الكلب. IHC هي واحدة من المقايسات الأكثر شيوعا على الأنسجة الثابتة الفورمولين.مع أجسام مضادة محددة ، يمكن استخدامه للكشف عن مسببات الأمراض ذات الصلة. لبدء هذا الإجراء، ضع ثلاثة إلى خمسة ملليمترات من أنسجة الدماغ، التي تم جمعها بعد التشريح، في محلول فورمالين مخزن بنسبة 10٪ لمدة 24 إلى 72 ساعة. سجل وزن الأنسجة التقريبي ونوع الأنسجة وحجم الفورمالين.ضع الأنسجة في الإيثانول 70٪ لتخزين الأنسجة لفترة أطول بعد تثبيت الفورمولين، وقبل المعالجة. بعد تثبيت العينة، قم بتشريح الأنسجة لتشمل مناطق الدماغ الهامة، مثل المقاطع العرضية من جذع الدماغ أو المخيخ أو قرن آمون. كل، وقطع إلى سمك بين ثلاثة وخمسة ملليمترات.ضع الأنسجة في أشرطة المعالجة. معالجة أشرطة الأنسجة لتسلل شمع البارافين. تضمينها في كتل البارافين وقسمها على microtome.قم أولا بإعداد طبق التلطيخ كما هو موضح في الشكل 1 من بروتوكول النص. ملء كل طبق مع 250 ملليلتر من الحل المعد. لإعداد AEC الركيزة الأسهم الحل، استخدم ماصة زجاجية لإذابة قرص واحد 20 ملليغرام من AEC في 5 ملليلتر من N، N-Dimethylformamide.لإعداد محلول الأسهم بروتياز، حل 7 ملليغرام من بروتياز في 200 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. لإعداد العازلة شطف، إضافة 100 ملليلتر من توين 80 إلى 990 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وتخلط جيدا لتشكيل حل متجانس من PBT-T. باستخدام microtome، وجعل قسم البارافين خمسة ميكرومتر.تحميل القسم على حمام مائي في 38 درجة مئوية وجمعها على الشرائح الزجاجية. تسمية الشرائح بقلم مقاوم للكواشف. ضعي الشرائح على صينية وتذوب في الفرن على حرارة تتراوح بين 55 و60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.ثم، قم بإزالة الشرائح من الفرن وإزالة البارافينيز على الفور، وذلك باستخدام 3 شطف الزيلين متتالية من 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك، إعادة ترطيب المقاطع على الشريحة عن طريق الغمر المتتابع في تقليل تخفيف الإيثانول إلى الماء deionized، كما هو موضح في بروتوكول النص. علاج الشرائح مع بروتياز لمدة 30 دقيقة لاسترجاع مستضد بروتيوليك، ثم شطف الشرائح في PBS-T لمدة 10 دقائق، وعلاجها مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق. للبدء، قم بإزالة شريحة واحدة من المخزن المؤقت، مع التأكد من التعامل مع شريحة واحدة فقط في كل مرة، بينما تبقى الشرائح الأخرى مغمورة بالمياه، واستخدم منشفة ورقية لمسح المخزن المؤقت الزائد من حول قسم الأنسجة. ضع الشرائح في غرفة الرطوبة واحتضنها بمصل الماعز العادي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك ، احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة مع الأجسام المضادة الأولية المثلى المحددة سلفا لمكافحة داء الكلب ، والأجسام المضادة للتحكم السلبي ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة دون غسل بينهما. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مع PBS-T لمدة 10 دقائق واحتضنها في غرفة الرطوبة مع الأجسام المضادة ذات المستويات الحيوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق.احتضان الشرائح وغرفة الرطوبة مع تقسيم الشريط ومجمع HRB في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وغسل برنامج تلفزيوني-T لمدة 10 دقائق. ثم، احتضان مع AEC في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. غسل الشرائح في الماء deionized لمدة 10 دقائق و counterstain مع Hematoxilyn جيل، المخفف 1-2 مع الماء deionized لمدة دقيقتين.بعد ذلك، شطف قبالة hematoxylin الزائدة عن طريق تراجع الشطف الشرائح في الماء deionized. شطف الشرائح في مياه الصنبور سكوت لمدة 30 ثانية ويغسل في الماء deionized لمدة 10 دقائق. إزالة الشرائح واحد في وقت واحد وتركيبها مع الماء للذوبان في تركيب المتوسطة.ثم استخدم مجهر ضوئي لقراءة الشرائح. في هذه الدراسة، يتم إثبات اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب كاختبار تشخيصي بديل للأنسجة الثابتة بالفورملين. تظهر هنا نتيجة تلطيخ الكيمياء المناعية التمثيلية لعينات التحكم الإيجابية والسلبية في أنسجة الدماغ المختلفة ، بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ وخلايا البوركينجي ، وفرس النهر.تلطيخ أحمر أرجواني، والذي يشير إلى تطور اللون باستخدام ركيزة AEC على خلفية زرقاء مضادة للملطخة، ويرجع ذلك إلى التفاعل من الأجسام المضادة ضد مستضد داء الكلب. نتيجة إيجابية في الكيمياء المناعية يتوافق مع تلطيخ أحمر أرجواني في أقسام الأنسجة. تلطيخ إدراج السيتوبلازمي وشوائب الحبيبية من حجم متفاوتة تدل على عينات إيجابية لالتهابات RABV.وتعتبر العينات سلبية إذا لم يلاحظ تلطيخ أحمر محدد أو فقط الخلفية الزرقاء، بسبب الهيماتوكسيلين. بالإضافة إلى التلطيخ الإيجابي ، يمكن أن يوفر توزيع التضمينات قياسا كميا غير مباشر لمستويات مستضد داء الكلب في العينة ، والتي قد تتوافق مع الحمل الفيروسي لعينة الأنسجة. بغض النظر عن مستويات التوزيع، فإن أي تلطيخ محدد سيصنف العينة على أنها إيجابية للكشف عن مستضد RABV.يجب إصلاح الأنسجة بشكل كاف في الفورملين ، وتجنب تجميد الأنسجة أثناء هذه العملية. يتم الكشف عن مستضد داء الكلب من قبل IHC ، ثم يمكن إجراء التقنيات الجزيئية على أقسام البارافين لتحديد متغير فيروس ليسا استنادا إلى معلومات تسلسل الحمض النووي الريبي. وينبغي التعامل مع الكواشف مثل الزيلين والفورمالين في أغطية الدخان.وينبغي توخي الحذر أثناء التعامل مع AEC كما هو مادة مسرطنة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

تشخيص السل الرئوي مع اختبار MTB / RIF كسبيرت

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

مقاربة الرواية تسليخ مجهري ليتعافى<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; نصوص محددة من الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة أورام حبيبية

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

الكشف عن خلايا الدم البيضاء الإنسان مستضد المؤشرات الحيوية في سرطان الثدي الاستفادة تسمية خالية جهاز الاستشعار البيولوجي تقنية

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

جيل من اللونين مستضد ميكروأرس للكشف في وقت واحد من مفتش والغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الذاتية

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...