Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
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Nous remercions les laboratoriens, les épidémiologistes et les affiliés des départements de santé publique pour les soumissions d’échantillons aux Centers for Disease Control and Prevention. Les résultats et conclusions de ce rapport sont ceux des auteurs et ne représentent pas nécessairement la position officielle des Centers for Disease Control and Prevention. L’utilisation de noms commerciaux et de sources commerciales est uniquement à des fins d’identification et n’implique pas l’approbation par les Centers for Disease Control and Prevention.

Bien que le protocole IHC ait été effectué sur des tissus fixés au for formel, qui inactivent le RABV s’il est présent, les protocoles de biosécurité appropriés doivent être correctement suivis. Toutes les procédures de biosécurité sont décrites dans la 5e édition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) de La biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL), y compris le port d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et l’exigence de v...

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. 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En raison du taux élevé de mortalité de la rage après l’apparition des symptômes, le diagnostic d’animaux suspects d’infection par le RABV est extrêmement critique pour un traitement prophylactique post-exposition approprié. Le diagnostic de la rage dépend principalement des techniques basées sur le DFA, le DRIT et la PCR utilisant des tissus frais ou congelés. Pour tester les tissus fixés au for formel, le test IHC fournit une méthode alternative pour la détection sensible et spécifique de l’antig?...

La rage est une encéphalite progressive aiguë causée par les virus à ARN à sens négatif appartenant au genre lyssavirus1. Près de 99% de tous les décès humains causés par l’infection par le virus de la rage (RABV), le type membre du genre, sont transmis par les chiens2. Le diagnostic de la rage chez les animaux suspects repose sur la détection d’antigènes (principalement des nucléoprotéines codées virales, protéine N) en complexe avec de l’ARN génomique (complexe ribonucléoprotéique, RNP) dans le tissu cérébral3. La détection de l’antigène par le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic de la rage4. La méthode utilise du matériel cérébral congelé frais ou frais, une empreinte tactile sur une lame, une fixation dans l’acétone, une coloration à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux marqués à l’isothiocyanate fluorescent (FITC) disponibles dans le commerce (mAbs / pAbs) et lus par la microscopie à fluorescence5. Le test DFA est rapide, sensible et spécifique à la détection de l’antigène de la rage dans les tissus cérébraux frais. Récemment, il a été démontré qu’un test immunohistochimique rapide direct (DRIT), une technique d’immunohistochimie modifiée (IHC), présentait une sensibilité similaire à celle du DFA, mais offre l’avantage de la microscopie optique pour la visualisation6. Bien que la méthode de détection utilisée dans le DRIT soit similaire à l’IHC, l’étape initiale utilise des tissus frais ou congelés pour générer des empreintes tactiles de l’échantillon, suivies d’une fixation dans du formain.
L’IHC est une technique largement utilisée pour déterminer les changements histologiques et la détection des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques dans des tissus fixés au for formel incorporés dans des blocs de paraffine. L’IHC est un test alternatif établi pour la détection de l’antigène de la rage dans les coupes tissulaires7. L’IHC a été particulièrement utilisé pour le diagnostic des cas rétrospectifs présentant des maladies neurologiques afin de déterminer le fardeau de la rage8. Les tissus fixés au for formel incorporés dans la paraffine préservent les protéines pour la détection même après plusieurs années lorsqu’ils sont stockés à température ambiante9. Le traitement au forme modifie les protéines en réticulant et en modifiant les chaînes latérales des acides aminés, ce qui pourrait rendre les épitopes non réactifs contre les anticorps10. Alors que le test IHC pour la détection de l’antigène de la rage implique soit mAbs, soit pAbs, ce dernier est avantageux car plusieurs épitopes et lyssavirus divergents peuvent être détectés11.
Les étapes standard impliquées dans l’IHC sont la fixation des tissus par forgé, l’incorporation dans des blocs de paraffine, la section des tissus, la déparaffinisation et l’hydratation, la récupération de l’épitope, la réactivité contre les anticorps primaires et secondaires et le développement à l’aide de substrats chromogènes. Ce manuscrit décrit un compte rendu détaillé du protocole de diagnostic de la rage. Pour la détection de l’antigène de la rage, le sérum de souris immunisé avec le RABV (pAbs) généré aux Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis à Atlanta, en Géorgie, en combinaison avec des anticorps secondaires biotinylés anti-souris est utilisé. Les abdominaux biotinylés sont détectés par l’ajout du complexe streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) suivi du développement de la couleur avec un substrat d’amino-éthylcarbazole.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

L’une des principales modalités de diagnostic de la rage est la détection du complexe viral de ribonucléoprotéines (RNP) (antigène) dans les échantillons de tissus infectés. Bien que le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) ou le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) soient le plus souvent utilisés pour la détection de l’antigène, les deux tests nécessitent des tissus frais et / ou congelés pour les empreintes sur les lames avant la détection de l’antigène à l’aide d’anticorps. Si les échantillons sont prélevés et fixés dans du for formel, aucun des deux tests n’est optimal pour la détection de l’antigène, cependant, les tests peuvent être effectués par immunohistochimie conventionnelle (IHC) après intégration dans des blocs de paraffine et sectionnement. Avec cette méthode IHC, les tissus sont colorés avec des anticorps antirabiques, les sections sont déparaffinisées, l’antigène récupéré par protéolyse partielle ou d’autres méthodes, et incubé avec des anticorps primaires et secondaires. Les antigènes sont colorés à l’aide de peroxydase de raifort / carbazole d’éthyle aminé et contre-colorés avec de l’hématoxyline pour la visualisation à l’aide d’un microscope optique. En plus de la détection spécifique de l’antigène, la fixation du formoin offre d’autres avantages tels que la détermination des changements histologiques, des conditions détendues pour le stockage et le transport des échantillons (à température ambiante), la possibilité de tester des cas rétrospectifs et l’amélioration de la sécurité biologique grâce à l’inactivation d’agents infectieux.

La figure 2 montre les résultats représentatifs de coloration IHC d’échantillons témoins positifs et négatifs dans différents tissus cérébraux testés. La figure 2A, D, G représente des échantillons positifs à 200x, tandis que la figure 2B, E, H correspond à un grossissement de 400x, respectivement. Figure 2A-C</str...

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Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Nous présentons ici un protocole de test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel.

Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Les tissus utilisés pour l’immunohistochimie et l’histopathologie diagnostique sont systématiquement fixés dans du for formel tampon à 10% phosphate. La détection de l’antigène du virus de la rage dans le tissu cérébral qui a été fixé dans le formaline présente un défi unique, et le test IHC s’est avéré être une méthode sensible et spécifique pour la détection de l’antigène du virus de la rage. Le principal avantage de la biopsie ou d’autres méthodes de détection est que les antigènes peuvent être détectés par rapport à la morphologie tissulaire et cellulaire.Avec l’IHC, la localisation de l’antigène de la rage dans les tissus cérébraux et non cérébraux, fournit des informations supplémentaires qui ne pourraient pas être obtenues par des sections de coloration de routine à l’hématoxyline et à l’éosine. Les tests de diagnostic de la rage sont importants pour le début de la prophylaxie post-exposition chez les humains exposés au virus de la rage. L’IHC est l’un des tests les plus couramment effectués sur les tissus fixés au for formel.Avec des anticorps spécifiques, il peut être utilisé pour la détection d’agents pathogènes respectifs. Pour commencer cette procédure, placez des morceaux de tissu cérébral de trois à cinq millimètres, prélevés après une autopsie, dans une solution de forme tamponnée à 10% pendant 24 à 72 heures. Notez le poids approximatif des tissus, le type de tissu et le volume de forme.Placez les tissus dans de l’éthanol à 70% pour un stockage plus long des tissus après la fixation du forgé et avant le traitement. Après la fixation de l’échantillon, disséquez le tissu pour inclure les zones importantes du cerveau, telles que les coupes transversales du tronc cérébral, du cervelet ou de l’hippocampe. Chacun, coupé à une épaisseur comprise entre trois et cinq millimètres.Placez les tissus dans des cassettes de traitement. Traiter les cassettes de tissu pour l’infiltration de cire de paraffine. Intégrez-les dans des blocs de paraffine et sectionnez-les sur un microtome.Configurez d’abord le plat de coloration comme indiqué à la figure 1 du protocole de texte. Remplissez chaque plat avec 250 millilitres de la solution préparée. Pour préparer la solution de substrat d’AEC, utilisez une pipette en verre pour dissoudre un comprimé de 20 milligrammes d’AEC dans 5 millilitres de N, N-Diméthylformamide.Pour préparer la solution souche de protéase, dissoudre 7 milligrammes de protéase dans 200 millilitres de PBS. Pour préparer le tampon de rinçage, ajoutez 100 millilitres de Tween 80 à 990 millilitres de PBS, et mélangez bien pour former une solution homogène de PBT-T. À l’aide d’un microtome, faites une section de paraffine de cinq micromètres.Chargez la section au bain-marie à 38 degrés Celsius et rassemblez-la sur des lames de verre. Étiquetez les lames avec un stylo résistant aux réactifs. Placez les lames sur un plateau et faites fondre dans un four à 55 à 60 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, retirez les lames du four et déparaffinez-les immédiatement, en utilisant 3 rinçages au xylène consécutifs de 5 minutes chacun. Après cela, réhydratez les sections de la lame par immersions séquentielles dans des dilutions décroissantes d’éthanol en eau désionisée, comme indiqué dans le protocole de texte. Traiter les lames avec la protéase pendant 30 minutes pour la récupération de l’antigène protéolytique, puis rincer les lames dans PBS-T pendant 10 minutes et les traiter avec du peroxyde d’hydrogène à 3% pendant 10 minutes.Après cela, lavez à nouveau les lames avec PBS-T pendant 10 minutes. Pour commencer, retirez une lame du tampon, en vous assurant de ne manipuler qu’une seule lame à la fois, tandis que les autres restent immergées, et utilisez une serviette en papier pour éponger l’excès de tampon autour de la section de tissu. Placez les lames dans une chambre humide et incubez avec du sérum de chèvre normal à température ambiante pendant 15 minutes.Ensuite, incuber les lames dans la chambre d’humidité avec l’anticorps antirabique primaire à dilution prédéterminée optimale et les anticorps témoins négatifs, à température ambiante pendant 60 minutes sans lavage entre les deux. Après cela, lavez les lames avec du PBS-T pendant 10 minutes et incubez dans une chambre d’humidité avec l’anticorps biotinylé à température ambiante pendant 15 minutes. Lavez à nouveau les lames avec PBS-T pendant 10 minutes.Incuber les glissières et la chambre d’humidité avec la division en bande et le complexe HRB à température ambiante pendant 15 minutes et laver le PBS-T pendant 10 minutes. Ensuite, incuber avec de l’AEC dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 10 minutes. Lavez les lames dans de l’eau désionisée pendant 10 minutes et contre-tache avec l’hématoxilyn de Gill, diluée une à deux avec de l’eau désionisée pendant deux minutes.Après cela, rincez l’excès d’hématoxyline en rinçant les lames par trempage dans de l’eau désionisée. Rincez les lames dans l’eau du robinet de Scott pendant 30 secondes et lavez-les à l’eau désionisée pendant 10 minutes. Retirez les glissières une à la fois et montez-les avec un support de montage soluble dans l’eau.Ensuite, utilisez un microscope optique pour lire les diapositives. Dans cette étude, un test chimique immunocytaire est démontré pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel. Un résultat représentatif de coloration chimique immunocytaire d’échantillons témoins positifs et négatifs dans différents tissus cérébraux est montré ici, y compris le tronc cérébral, les cellules du cervelet et du purkinje, et l’hippocampe.La coloration rouge magenta, qui indique le développement de la couleur en utilisant un substrat AEC sur le fond bleu contre-coloré, est due à la réactivité des anticorps contre l’antigène de la rage. Un résultat positif en immunohistochimie correspond à la coloration rouge magenta dans les sections de tissus. La coloration des inclusions cytoplasmiques et des inclusions granulaires de taille variable indique que les échantillons sont positifs pour les infections à RABV.Les échantillons sont considérés comme négatifs si aucune coloration rouge spécifique ou seulement le fond bleu, dû à l’hématoxyline, n’a été observé. En plus de la coloration positive, la distribution des inclusions pourrait fournir une quantification indirecte des niveaux d’antigène de la rage dans l’échantillon, ce qui pourrait correspondre à la charge virale de l’échantillon de tissu. Quels que soient les niveaux de distribution, toute coloration spécifique classera l’échantillon comme positif pour la détection de l’antigène RABV.Les tissus doivent être fixés adéquatement dans le for formel et éviter de congeler les tissus pendant ce processus. L’antigène de la rage est détecté par l’IHC, puis des techniques moléculaires peuvent être effectuées sur des coupes de paraffine pour déterminer la variante du lyssavirus en fonction des informations de séquence d’ARN. Les réactifs comme le xylène et le forme doivent être manipulés dans des hottes.Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de l’AEC car il s’agit d’un cancérogène.

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