Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
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हम रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्रों के लिए नमूना प्रस्तुतियां के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य विभागों के साथ प्रयोगशालाओं, महामारी विज्ञानियों, और सहयोगी कंपनियों का शुक्रिया अदा करते हैं । निष्कर्ष और इस रिपोर्ट में निष्कर्ष लेखकों के उन है और जरूरी रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्रों की आधिकारिक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते । व्यापार के नाम और वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग केवल पहचान के लिए कर रहे है और रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा समर्थन मतलब नहीं है ।

जबकि आईएचसी प्रोटोकॉल फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों पर किया गया था, जो यदि मौजूद है तो आरएबीवी को निष्क्रिय करता है, उचित जैवसेफ्टी प्रोटोकॉल का उचित पालन किया जाना चाहिए। सभी जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं को मा?...

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	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens.">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li><li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+five+year+(1985-1989)+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies.">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues.">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections.">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li><li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies+prevention--United+States,+2008:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices.">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).</li><li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test.">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses.">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li></ol>

लक्षण शुरुआत के बाद रेबीज की उच्च मृत्यु दर के कारण, राबव संक्रमण के लिए संदिग्ध जानवरों का निदान एक उपयुक्त पोस्ट-एक्सपोजर रोगनिरोधी उपचार के लिए बेहद महत्वपूर्ण है। रेबीज निदान मुख्य रूप से ताजा या ?...

रेबीज एक तीव्र प्रगतिशील इंसेफेलाइटिस है जो1जीनस से संबंधित नकारात्मक भावना आरएनए वायरस के कारण होता है । रेबीज वायरस (RABV), जीनस के प्रकार के सदस्य के साथ संक्रमण की वजह से सभी मानव मौतों का लगभग ९९%, कुत्तों द्वारा प्रेषित किया जाता है2। संदिग्ध जानवरों का रेबीज निदान मस्तिष्क केऊतकोंमें जीनोमिक आरएनए (राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स, आरएनपी) के साथ जटिल में एंटीजन (मुख्य रूप से वायरल एन्कोडेड न्यूक्लियोप्रोटीन, एन प्रोटीन) का पता लगाने पर निर्भर करता है। डायरेक्ट फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण द्वारा एंटीजन डिटेक्शन को रेबीज निदान 4 के लिए स्वर्ण मानक मानाजाताहै। विधि ताजा या ताजा जमे हुए मस्तिष्क सामग्री का उपयोग करती है, एक स्लाइड पर एक स्पर्श छाप, एसीटोन में निर्धारण, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट आइसोथियोसायनेट (फिटसी) लेबल मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी/पीएब्स) लेबल का उपयोग करते हैं और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी5द्वारा पढ़ते हैं। डीएफए परीक्षण ताजा मस्तिष्क ऊतक में रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट है। हाल ही में, एक प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी), संशोधित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) तकनीक, डीएफए के प्रति इसीतरहकी संवेदनशीलता प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शित की गई थी, लेकिन दृश्य 6 के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का लाभ प्रदान करती है। जबकि डीआरआईटी में उपयोग की जाने वाली डिटेक्शन विधि आईएचसी के समान है, प्रारंभिक चरण औपचारिक रूप से निर्धारण के बाद नमूने के स्पर्श इंप्रेशन उत्पन्न करने के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों का उपयोग करता है।
आईएचसी पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों में विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों और प्रोटीन का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। आईएचसी ऊतक अनुभाग 7 में रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए एकस्थापितवैकल्पिक परीक्षण है। आईएचसी का उपयोग विशेष रूप से पूर्वव्यापी मामलों के निदान के लिए किया गया है, जिन्होंने रेबीज8के बोझ को निर्धारित करने के लिए न्यूरोलॉजिकल रोगों का प्रदर्शन किया । पैराफिन-एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतक कई वर्षों के बाद भी पता लगाने के लिए प्रोटीन को संरक्षित करते हैं जब परिवेश तापमान 9 पर संग्रहीतहोताहै। फॉर्मेलिन उपचार अमीनो एसिड साइड चेन को क्रॉस-लिंकिंग और फेरबदल करके प्रोटीन को संशोधित करता है, जो एपिटोप्स को एंटीबॉडी10के खिलाफ अब प्रतिक्रियाशील नहीं बना सकता है। जबकि रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए आईएचसी परीक्षण में या तो एमएबी या पीएएस शामिल है, बाद में कई एपिटोप और अलग-अलग lyssaviruses का पता लगाया जा सकता है11के रूप में लाभप्रद है।
आईएचसी में शामिल मानक कदम ऊतकों के औपचारिक निर्धारण, पैराफिन ब्लॉकों में एम्बेडिंग, ऊतकों की धारा, डिपैराफिनाइजेशन और हाइड्रेशन, एपिटोप रिकवरी, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रतिक्रियाशीलता, और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट्स का उपयोग करके विकास हैं। यह पांडुलिपि रेबीज निदान के लिए प्रोटोकॉल के विस्तृत विवरण का वर्णन करती है। रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए, अमेरिका के रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) अटलांटा, जॉर्जिया में उत्पन्न राब वी (पीएब्स) के साथ प्रतिरक्षित माउस सीरम का उपयोग बायोटिनेलेटेड एंटी-माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन में किया जाता है। बायोटिनेलेटेड एब्स का पता स्ट्रेप्टाविडिन-सहिजन पेरोक्सिडेस (एचआरपी) कॉम्प्लेक्स के अलावा पता लगाया जाता है जिसके बाद अमीनो-एथिलकारबाजोल सब्सट्रेट के साथ रंग विकास होता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

रेबीज के लिए प्राथमिक नैदानिक तौर-तरीकों में से एक संक्रमित ऊतक नमूनों में वायरल राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसर (एंटीजन) का पता लगाना है। जबकि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण या प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी) का उपयोग आमतौर पर एंटीजन डिटेक्शन के लिए किया जाता है, दोनों परीक्षणों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीजन डिटेक्शन से पहले स्लाइड पर इंप्रेशन के लिए ताजा और/या जमे हुए ऊतकों की आवश्यकता होती है । यदि नमूनों को एकत्र किया जाता है और फॉर्मेलिन में तय किया जाता है, तो एंटीजन डिटेक्शन के लिए न तो परीक्षण इष्टतम होता है, हालांकि, पैराफिन ब्लॉक और सेक्शनिंग में एम्बेड करने के बाद पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। इस आईएचसी विधि के साथ, ऊतकों को एंटी-रेबीज एंटीबॉडी से सना हुआ होता है, वर्गों को डिपैराफिनाइज्ड किया जाता है, आंशिक प्रोटेओलिसिस या अन्य तरीकों से एंटीजन प्राप्त किया जाता है, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड होता है। एंटीजन सहिजन पेरोक्सिडास/अमीनो एथिल कार्बाजोल का उपयोग करके दाग रहे हैं और हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दृश्य के लिए हेमेटॉक्सीलिन के साथ जवाबी दाग रहे हैं। विशिष्ट एंटीजन डिटेक्शन के अलावा, फॉर्मेलिन निर्धारण हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों के निर्धारण, नमूना भंडारण और परिवहन (परिवेश के तापमान के तहत), पूर्वव्यापी मामलों का परीक्षण करने की क्षमता और संक्रामक एजेंटों की निष्क्रियता के माध्यम से बेहतर जैविक सुरक्षा जैसे अन्य फायदे प्रदान करता है।

चित्रा 2 विभिन्न मस्तिष्क ऊतकों परीक्षण में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के प्रतिनिधि आईएचसी धुंधला परिणाम दर्शाता है। चित्रा 2ए, डी, जी 200x में सकार?...

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Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के लिए वैकल्पिक नैदानिक परीक्षण के रूप में रेबीज वायरस एंटीजन का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों से Lyssavirus एंटीजन डिटेक्शन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री टेस्ट

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए और नैदानिक हिस्टोपैथोलॉजी के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक नियमित रूप से 10% फॉस्फेट बफर फॉर्मेलिन में तय किए जाते हैं। फॉर्मेलिन में तय किए गए ब्रेन टिश्यू में रेबीज वायरस एंटीजन का पता लगाना एक अनोखी चुनौती पेश करता है और आईएचसी टेस्ट में रेबीज वायरस एंटीजन डिटेक्शन के लिए संवेदनशील और विशिष्ट तरीका पाया गया है। बायोप्सी या अन्य पता लगाने के तरीकों का प्राथमिक लाभ यह है कि ऊतक और सेलुलर आकृति विज्ञान के संबंध में एंटीजन का पता लगाया जा सकता है।आईएचसी के साथ, मस्तिष्क और गैर-मस्तिष्क ऊतकों में रेबीज एंटीजन का स्थानीयकरण, अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है जिसे नियमित हेमटॉक्सीलिन और इओसिन दाग वर्गों के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। रेबीज वायरस के संपर्क में मनुष्यों में पोस्ट-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस की शुरुआत के लिए रेबीज नैदानिक परीक्षण महत्वपूर्ण है। आईएचसी फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों पर सबसे अधिक प्रदर्शन करने वाले परख में से एक है।विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ, इसका उपयोग संबंधित रोगजनकों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों के तीन से पांच मिलीमीटर टुकड़े रखें, जो नेक्रॉप्सी के बाद एकत्र किए गए हैं, 24 से 72 घंटे के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन समाधान में। अनुमानित ऊतक वजन, ऊतक प्रकार, और फॉर्मेलिन की मात्रा रिकॉर्ड करें।फॉर्मेलिन निर्धारण के बाद और प्रसंस्करण से पहले लंबे समय तक ऊतक भंडारण के लिए ऊतकों को 70% इथेनॉल में रखें। नमूना निर्धारण के बाद, ऊतक को काटना महत्वपूर्ण मस्तिष्क क्षेत्रों को शामिल करने के लिए, जैसे ब्रेनस्टेम के क्रॉस सेक्शन, सेरिबैलम, या हिप्पोकैम्पस। प्रत्येक, तीन और पांच मिलीमीटर के बीच एक मोटाई के लिए काट दिया ।ऊतकों को प्रोसेसिंग कैसेट में रखें। पैराफिन वैक्स घुसपैठ के लिए टिश्यू कैसेट को प्रोसेस करें। उन्हें पैराफिन ब्लॉक में एम्बेड करें और उन्हें माइक्रोटॉम पर सेक्शन करें।सबसे पहले पाठ प्रोटोकॉल के चित्रा 1 में उल्लिखित धुंधला पकवान स्थापित करें। तैयार समाधान के 250 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक पकवान भरें। एईसी सब्सट्रेट स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के लिए, एन-डिमेथाइलफार्मेमाइड के 5 मिलीलीटर में एईसी के एक 20 मिलीग्राम टैबलेट को भंग करने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें।प्रोटीज स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के लिए, पीबीएस के 200 मिलीलीटर में प्रोटीज के 7 मिलीग्राम को भंग करें। कुल्ला बफर तैयार करने के लिए, पीबीएस के 80 से 990 मिलीलीटर ट्वीन के 100 मिलीलीटर जोड़ें, और पीबीटी-टी का एक समरूप समाधान बनाने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। एक माइक्रोटॉम का उपयोग करके, पांच माइक्रोमीटर पैराफिन सेक्शन बनाएं।38 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान पर खंड लोड और कांच स्लाइड पर इसे इकट्ठा। एक अभिवाक प्रतिरोधी कलम के साथ स्लाइड लेबल। स्लाइड्स को एक ट्रे पर रखें और एक घंटे के लिए 55 से 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में पिघल जाएं।फिर, ओवन से स्लाइड निकालें और तुरंत उन्हें डिपैराइज़ करें, लगातार 5 मिनट के 3 जाइलीन कुल्ला का उपयोग करके। इसके बाद, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित पानी को डियूनाइज्ड करने के लिए इथेनॉल के कमजोर पड़ने को कम करने में अनुक्रमिक विसर्जन द्वारा स्लाइड पर वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें। प्रोटियोलिटिक एंटीजन रिट्रीवल के लिए 30 मिनट के लिए प्रोटीज के साथ स्लाइड्स का इलाज करें, फिर 10 मिनट के लिए पीबीएस-टी में स्लाइड्स को कुल्ला करें, और उन्हें 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ ट्रीट करें ।इसके बाद 10 मिनट तक पीबीएस-टी से फिर से स्लाइड्स धो लें। शुरू करने के लिए, बफर से एक स्लाइड निकालें, एक समय में केवल एक स्लाइड को संभालना सुनिश्चित करें, जबकि अन्य जलमग्न रहते हैं, और ऊतक अनुभाग के चारों ओर से अतिरिक्त बफर को दागने के लिए एक पेपर तौलिया का उपयोग करते हैं। स्लाइड्स में एक आर्द्रता कक्ष में रखें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सामान्य बकरी सीरम के साथ इनक्यूबेट करें।इसके बाद, इष्टतम पूर्व निर्धारित कमजोर पड़ने प्राथमिक एंटी रेबीज एंटीबॉडी, और नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ आर्द्रता कक्ष में स्लाइड इनक्यूबेट, बीच में कोई वॉश के साथ ६० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर । इसके बाद, 10 मिनट के लिए पीबीएस-टी के साथ स्लाइड धोएं और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी के साथ आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए पीबीएस-टी के साथ फिर से स्लाइड्स धोएं ।स्लाइड्स और आर्द्रता कक्ष को स्ट्रिप डिवाइड और एचआरबी कॉम्प्लेक्स के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और पीबीएस-टी को 10 मिनट तक धोएं । फिर, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता कक्ष में एईसी के साथ इनक्यूबेट। स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए डिओनाइज्ड वॉटर में धोएं और गिल के हेमेटॉक्सिलिन के साथ काउंटरटाइन, दो मिनट के लिए डिओनाइज्ड पानी से एक से दो पतला ।इसके बाद, डिओनाइज्ड पानी में स्लाइड्स को रिंस करके अतिरिक्त हेमटॉक्सीलिन को कुल्ला करें। 30 सेकंड के लिए स्कॉट नल के पानी में स्लाइड कुल्ला और 10 मिनट के लिए deionized पानी में धो । स्लाइड्स एक बार में निकालें और उन्हें पानी में घुलनशील बढ़ते मीडियम के साथ माउंट करें।इसके बाद आगे की स्लाइड्स में पढ़िए हल्के माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करें। इस अध्ययन में फॉर्मेलिन-फिक्स्ड टिश्यू के लिए वैकल्पिक नैदानिक परीक्षण के रूप में रेबीज वायरस एंटीजन का पता लगाने के लिए इम्यूनोसाइटिक केमिस्ट्री टेस्ट का प्रदर्शन किया जाता है। मस्तिष्क के विभिन्न ऊतकों में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों का एक प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटिक रसायन धुंधला परिणाम यहां दिखाया गया है, जिसमें ब्रेनस्टेम, सेरिबैलम और पुरकिंजे कोशिकाएं और हिप्पोकैम्पस शामिल हैं।मैजेंटा लाल धुंधला, जो नीले जवाबी पृष्ठभूमि के खिलाफ एईसी सब्सट्रेट का उपयोग करके रंग विकास को इंगित करता है, रेबीज एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी की प्रतिक्रियाशीलता के कारण है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में एक सकारात्मक परिणाम ऊतक वर्गों में मैजेंटा लाल धुंधला से मेल खाती है। साइटोप्लाज्मिक समावेशन और अलग-अलग आकार के दानेदार समावेशन का धुंधला हिस्सा आरएबीवी संक्रमणों के लिए सकारात्मक नमूनों का संकेत है।नमूनों को नकारात्मक माना जाता है यदि कोई विशिष्ट लाल धुंधला या केवल नीली पृष्ठभूमि, हेमटॉक्सीलिन के कारण, देखी गई। सकारात्मक धुंधला करने के अलावा, समावेशन का वितरण नमूने में रेबीज एंटीजन के स्तर का अप्रत्यक्ष मात्राकरण प्रदान कर सकता है, जो ऊतक नमूने के वायरल लोड के अनुरूप हो सकता है। वितरण के स्तर के बावजूद, किसी भी विशिष्ट धुंधला आरएबीवी एंटीजन डिटेक्शन के लिए सकारात्मक के रूप में नमूना वर्गीकृत करेगा।ऊतकों को फॉर्मेलिन में पर्याप्त रूप से तय किया जाना चाहिए, और इस प्रक्रिया के दौरान ऊतकों को ठंडा करने से बचना चाहिए। रैबीज एंटीजन आईएचसी द्वारा पता लगाया जाता है, फिर आरएनए अनुक्रम जानकारी के आधार पर Lyssavirus संस्करण निर्धारित करने के लिए पैराफिन वर्गों पर आणविक तकनीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है। जाइलीन और फॉर्मेलिन जैसे रीएजेंट्स को धूम हुड में संभाला जाना चाहिए।एईसी को संभालते समय देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि यह एक कैंसरजन है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

संक्रामक वायरस के फील्ड एकत्र मच्छरों से वेरो सेल संस्कृति परख द्वारा जांच

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

में Xpert टेस्ट / एमटीबी राइफल्स के साथ फेफड़े के क्षय रोग निदान

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

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Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

लेबल मुक्त Biosensor प्रौद्योगिकी का उपयोग स्तन कैंसर में मानव ल्युकोसैट प्रतिजन biomarkers की डिटेक्शन

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

मातृ-भ्रूण इंटरफेस पर Murine ऊतकों से leukocytes की अलगाव

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

स्वाइन से इन्फ्लुएंजा ए वायरस का पता लगाने और अलगाव के लिए नाक पोंछे

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

आईजीजी और आईजीएम Autoantibodies का एक साथ जांच के लिए दो-रंग एंटीजन प्रोटीन की पीढ़ी

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

का पता लगाने और दुर्लभ के संवर्धन विशिष्ट प्रतिजन phenotype और समारोह के विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

अलगाव, लक्षण वर्णन, और मोटापे से संबंधित सूजन से प्रभावित ऊतकों से मैक्रोफेज की शुद्धि

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...