Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
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우리는 질병 통제 및 예방 센터에 견본 제출을 위한 공중 위생 부서와 가진 실험실, 역학자 및 계열사에게 감사합니다. 이 보고서의 사실 인정 그리고 결론은 저자의 그이며 반드시 질병 통제 및 예방 센터의 공식적인 위치를 대표하지 않습니다. 무역 이름과 상업 소스의 사용은 식별을위한 것이며 질병 통제 및 예방 센터의 보증을 의미하지는 않습니다.

IHC 프로토콜은 포르말린 고정 조직에서 수행되었지만, 이 조직이 있는 경우 RABV를 비활성화하는 동안 적절한 생체 안전 프로토콜을 적절히 따라야 합니다. 모든 생물안전 절차는 미생물 및 생물의학 연구소(BMBL) 제5판(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)의 생물안전에 설명되어 있으며, 여기에는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용을 포함한, 그리고12에기술된 바와 같이 예?...

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	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. 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증상 발병 후 광견병의 높은 사망률로 인해 RABV 감염에 대한 의심스러운 동물의 진단은 적절한 노출 후 예방 치료에 매우 중요합니다. 광견병 진단은 주로 신선하거나 냉동 된 조직을 사용하여 DFA, DRIT 및 PCR 기반 기술에 달려 있습니다. 포르말린 고정 조직의 테스트를 위해 IHC 검사는 RABV 항원의 민감하고 특정 검출을 위한 대체 방법을 제공합니다. 포르말린에 고정된 조직은 교차 연결같이 측사슬...

광견병은 속 리사바이러스1에속하는 부정적인 감각 RNA 바이러스에 의해 유발되는 급성 진행성 뇌염이다. 광견병 바이러스 (RABV)로 인한 모든 인간 사망의 거의 99 %는 개2에의해 전달됩니다. 의심되는 동물의 광견병 진단은 뇌 조직3에서게놈 RNA (리보뉴클레오 단백질 복합체, RNP)와 복합체에서 항원 (주로 바이러스 인코딩 뉴클레오 단백질, N 단백질)의 검출에 의존한다. 직접 형광 항체(DFA) 시험에 의한 항원 검출은 광견병 진단4에대한 금본위제로 간주된다. 이 방법은 신선하거나 신선한 냉동 뇌 물질, 슬라이드에 터치 인상, 아세톤에 고정, 시판되는 형광 이소티오카네이트(FITC)를 사용하여 염색하고 단클론 또는 폴리클론 항체(mAbs/pAbs)로 표시하고 형광 현미경검사법 5에의해 읽습니다. DFA 시험은 신선한 두뇌 조직에서 광견병 항원 검출을 위해 급속하고, 민감하고, 특정합니다. 최근에는 직접 신속한 면역조직화학시험(DRIT), 수정된 면역조직화학(IHC) 기술이 DFA와 유사한 민감성을 나타내고 있음을 입증했지만, 시각화를 위한 광현미경검사의 장점을6. DRIT에서 사용되는 검출 방법은 IHC와 유사하지만 초기 단계는 신선하거나 냉동된 조직을 사용하여 시료의 터치 노출을 생성한 다음 포르말린에 고정됩니다.
IHC는 파라핀 블록에 내장된 포르말린 고정 조직에서 특정 항체를 사용하여 단백질의 조직학적 변화 및 검출을 결정하는 데 널리 사용되는 기술이다. IHC는 조직 섹션7에서광견병 항원 검출을 위한 확립된 대체 시험이다. IHC는광견병8의 부담을 결정하기 위해 신경질환을 전시한 회고적 사례의 진단을 위해 특히 활용되고 있다. 파라핀-임베디드 포멀린 고정 조직은 주변 온도9에저장될 때 몇 년 후에도 검출을 위한 단백질을 보존한다. 포르말린 치료는 아미노산 측면 사슬을 교차 연결하고 변경하여 단백질을 수정하여, 이는 에피토프가 항체에 대해 더 이상 반응하지 않을 수있습니다(10). 광견병 항원 검출을 위한 IHC 시험은 mAbs 또는 pAbs를 포함하지만, 후자는 다중 에피토프및 발산 리사바이러스가11을검출할 수 있기 때문에 유리하다.
IHC에 관여하는 표준 단계는 조직의 포르말린 고정, 파라핀 블록에 포함, 조직의 단면화, 분리 및 수분 공급, 에피토프 복구, 1 차 및 이차 항체에 대한 반응성, 및 염색체 기판을 사용하여 개발. 이 원고는 광견병 진단을위한 프로토콜의 상세한 설명을 설명합니다. 광견병 항원 검출의 경우, 미국 질병통제예방센터(CDC)에서 생성된 RABV(pAbs)로 면역화된 마우스 혈청이 생물신생 항마우스 이차 항체와 함께 활용된다. 생물요닉 복근은 스트렙타비딘-고추냉이 과로시다제(HRP) 복합체의 첨가에 의해 검출되고, 아미노 에틸카르바졸 기판으로 색이 발달한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

광견병에 대한 1 차적인 진단 양식의 한은 감염된 조직 견본에 있는 바이러스성 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (항원)의 검출입니다. 직접 형광 항체(DFA) 테스트 또는 직접적인 신속한 면역 조직화학 시험(DRIT)이 항원 검출에 가장 일반적으로 활용되지만, 두 검사 모두 항체를 사용하여 항원 검출 전에 슬라이드에 대한 노출을 위해 신선 및/또는 냉동 조직을 필요로 한다. 시료를 포름포민에서 채취및 고정하는 경우, 어느 테스트도 항원 검출에 최적이지만, 파라핀 블록 및 단면에 포함된 후 종래의 면역히토화학(IHC)에 의해 시험을 수행할 수 있다. 이 IHC 방법을 사용하면 조직은 항 광견병 항체로 염색되고, 섹션은 탈파화되고, 부분 적인 proteolysis 또는 그밖 방법에 의해 회수된 항원, 및 1 차 및 이차 항체로 배양됩니다. 항원은 고추냉이 과록시다제/아미노 에틸 카르바졸을 사용하여 염색되고 가벼운 현미경을 사용하여 시각화를 위해 헤마톡슬린으로 대응한다. 특정 항원 검출 외에도 포르말린 고정은 조직학적 변화의 결정, 표본 저장 및 운송을 위한 완화된 조건(주변 온도 미만), 회고적 사례를 테스트하는 능력 및 전염성 제의 불활성화를 통한 생물학적 안전 성 향상과 같은 다른 이점을 제공합니다.

도 2는 테스트된 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조샘플의 대표적인 IHC 염색 결과를 보여줍니다. 그림 2A,D, G는 200x에서 양수 샘플을 나타내고, 그림 2B, E, H는 각각 400배율에 해당한다. 도 2A-C는 뇌간에 해당; 도 2<strong...

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Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

면역 조직 화학 및 진단 조직 병리학에 사용되는 조직은 10 %인산염 완충체 포르말린에서 일상적으로 고정됩니다. 포르말린에 고정된 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출은 독특한 도전을 제시하며, IHC 검사는 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 민감하고 구체적인 방법인 것으로 밝혀졌다. 생검 또는 다른 검출 방법의 주요 장점은 항원조직 및 세포 형태학과 관련하여 검출될 수 있다는 것입니다.IHC를 사용하면 뇌 및 비 뇌 조직에서 광견병 항원을 국소화하여 일상적인 Hematoxylin 및 Eosin 얼룩 섹션을 통해 얻을 수 없는 추가 정보를 제공합니다. 광견병 진단 테스트는 광견병 바이러스에 노출된 인간에서 노출 후 예방을 개시하는 데 중요합니다. IHC는 포르말린 고정 조직에 대한 가장 일반적으로 수행되는 에세이 중 하나입니다.특정 항체를 사용하면, 각각의 병원체의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이 절차를 시작하려면, 뇌 조직의 3 ~ 5 밀리미터 조각을 배치, 부검 후 수집, 에 10% 버퍼링 포르말린 용액에 24 받는 시간 72 시간. 대략적인 조직 중량, 조직 모형 및 포르말린의 부피를 기록합니다.조직을 70%에 탄올에 배치하여 포식포닌 고정 후, 그리고 처리 전에 더 긴 조직 저장을 위해 배치합니다. 표본 고정에 따라, 뇌간, 소뇌, 또는 해마의 단면과 같은 중요한 뇌 영역을 포함하도록 조직을 해부한다. 각각 3~5밀리미터 의 두께로 자른다.조직을 카세트 처리에 넣습니다. 파라핀 왁스 침투를 위한 조직 카세트를 처리합니다. 파라핀 블록에 포함시키고 마이크로톤에 적어 두었습니다.먼저 텍스트 프로토콜의 그림 1에 설명된 대로 염색 접시를 설정합니다. 각 접시에 준비된 용액250밀리리터를 채웁니다. AEC 기판 스톡 솔루션을 준비하려면 유리 파이펫을 사용하여 N- N-Dimethylformamide의 5 밀리리터에 AEC의 20 밀리그램 정제를 용해하십시오.프로테아제스 스톡 솔루션을 준비하려면 PBS의 200 밀리리터에 프로테아제 7 밀리그램을 녹입니다. 헹구는 버퍼를 준비하려면 PBS의 80~990밀리리터의 100밀리리터를 추가하고 잘 섞어 PBT-T의 균일한 용액을 형성합니다. 마이크로토메를 사용하여 5마이크로미터 파라핀 섹션을 만듭니다.섭씨 38도의 수조에 있는 섹션을 적재하고 유리 슬라이드에 수집합니다. 슬라이드에 시약 방지 펜으로 레이블을 지정합니다. 슬라이드를 트레이에 놓고 오븐에서 섭씨 55~60도에서 1시간 동안 녹입니다.그런 다음 오븐에서 슬라이드를 제거하고 즉시 5 분의 3 연속 자일렌 헹구를 사용하여 즉시 분리합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 희석을 감소시켜 탈온화된 물에 순차적으로 침수하여 슬라이드의 섹션을 다시 수분화합니다. 프로테아제프로 슬라이드를 프로테아제프로 30분 간 치료한 다음 PBS-T에서 슬라이드를 10분 간 헹구고 과산화수산화수소를 10분 동안 3%로 처리합니다.그 후 PBS-T로 슬라이드를 10분 동안 다시 세척합니다. 시작하려면 버퍼에서 슬라이드 를 하나씩 제거하고 한 번에 하나의 슬라이드만 처리하고 다른 슬라이드는 침수 상태로 유지되고 종이 타월을 사용하여 조직 섹션 주위에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 습도 챔버에 넣고 실온에서 일반 염소 세럼으로 15 분 동안 배양하십시오.다음으로, 습도 챔버내의 슬라이드를 최적의 소정의 희석 1차 항광견 항체및 음수 대조항체로 60분 동안 실온에서 배양하여 그 사이에 세척없이 배양한다. 그 후, PBS-T로 슬라이드를 10분 간 세척하고 실온에서 생체화 항체를 15분 동안 습도 챔버에서 배양한다. PBS-T로 슬라이드를 10분 동안 다시 씻으십시오.슬라이드와 습도 챔버를 실온에서 스트립 분할 및 HRB 복합체로 15분 동안 배양하고 PBS-T를 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 실온에서 습도 챔버에서 AEC로 10 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 10분 동안 씻어내고 길의 헤마토시린으로 카운터스테인을 사용하여 2분 동안 탈온화된 물로 1-2를 희석시합니다.그 후, 탈이온화된 물에 미끄럼틀을 헹구어 과도한 헤마톡시린을 헹구십시오. 스콧의 수돗물에서 슬라이드를 30초 간 헹구고 탈온화된 물로 10분간 씻어내십시오. 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 수용성 장착 매체로 장착합니다.그런 다음 가벼운 현미경을 사용하여 슬라이드를 읽습니다. 이 연구에서는, 면역 세포 화학 시험은 포르말린 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로 광견병 바이러스 항원의 검출을 위해 입증됩니다. 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조 샘플의 대표적인 면역 세포 화학 염색 결과는 뇌간, 소뇌 및 purkinje 세포 및 해마를 포함하여 여기에 표시됩니다.청색 반염색 배경에 대한 AEC 기판을 사용하여 색 개발을 나타내는 마젠타 적색 염색은 광견병 항원에 대한 항체의 반응성 때문입니다. 면역조직화학의 양성 결과는 조직 단면도에서 자젠타 적색 염색에 해당한다. 세포질 포함 및 다양한 크기의 세분화 된 포함의 염색은 RABV 감염에 대해 긍정적 인 샘플을 나타냅니다.헤마톡슬린으로 인해 특정 적색 염색이나 파란색 배경만 관찰되지 않은 경우 시료는 부정적으로 간주됩니다. 양성 염색 이외에, 포함물의 분포는 조직 견본의 바이러스성 하중에 대응할 수 있는 견본에 있는 광견병 항원의 수준의 간접적인 정량화를 제공할 수 있었습니다. 분포 수준에 관계없이, 임의의 특정 염색은 RABV 항원 검출을 위한 양성으로 견본을 분류할 것입니다.조직은 포르말린에 적절하게 고정되어야하며,이 과정에서 조직을 동결하지 마십시오. 광견병 항원은 IHC에 의해 검출되고, 그 때 분자 기술은 RNA 서열 정보에 근거를 둔 Lyssavirus 이체를 결정하기 위하여 파라핀 단면도에서 수행될 수 있다. 자일렌과 포르말린과 같은 시약은 연기 후드에서 처리해야합니다.발암 물질이기 때문에 AEC를 취급하는 동안 주의해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

연구

면역학 및 감염병학

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Xpert MTB / 리프 시험과 폐 결핵 진단

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

복구하는 새로운 미세 절제 접근<em&gt; 결핵균</em폐 육아종 임베디드 포르말린 고정 파라핀에서&gt; 특정 성적 증명서

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...