Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
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Agradecemos aos laboratórios, epidemiologistas e afiliados às secretarias de saúde pública pelas submissões de amostras aos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. Os achados e conclusões deste relatório são dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. O uso de nomes comerciais e fontes comerciais são apenas para identificação e não implicam endosso pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Enquanto o protocolo IHC foi realizado em tecidos fixos de formalina, que inativam rabv se presente, protocolos de biossegurança apropriados devem ser devidamente seguidos. Todos os procedimentos de biossegurança estão descritos na Biossegurança nos Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL) 5ª Edição (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e exigência de vacinação conforme descrito12....

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	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus:+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles.">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consulation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).</li><li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. 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D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections.">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li><li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies+prevention--United+States,+2008:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices.">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).</li><li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test.">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. 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Devido à alta taxa de letalidade da raiva após o início dos sintomas, o diagnóstico de animais suspeitos para infecção por RABV é extremamente crítico para um tratamento profilático pós-exposição adequado. O diagnóstico da raiva depende principalmente de técnicas baseadas em DFA, DRIT e PCR usando tecidos frescos ou congelados. Para testes de tecidos fixos de formalina, o teste IHC fornece um método alternativo para a detecção sensível e específica do antígeno RABV. Embora os tecidos fixados em formal...

A raiva é uma encefalite progressiva aguda causada pelo sentido negativo vírus RNA pertencentes ao gênero lyssavirus1. Quase 99% de todas as mortes humanas causadas pela infecção pelo vírus da raiva (RABV), o tipo de membro do gênero, é transmitida por cães2. O diagnóstico de raiva de animais suspeitos baseia-se na detecção de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viral, n proteína) em complexo com RNA genômico (complexo de ribonucleoproteína, RNP) no tecido cerebral3. A detecção de antígeno pelo teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva4. O método utiliza material cerebral congelado fresco ou fresco, uma impressão de toque em um slide, fixação em acetona, coloração usando isothionato fluorescente comercialmente disponível (FITC) rotulados anticorpos monoclonais ou policclonais (mAbs/pAbs) e lidos pela microscopia de fluorescência5. O teste de DFA é rápido, sensível e específico para detecção de antígeno de raiva em tecido cerebral fresco. Recentemente, foi demonstrado um teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT), a técnica de imunohistoquímica modificada (IHC), que apresentou sensibilidade semelhante à DFA, mas oferece a vantagem da microscopia leve para visualização6. Embora o método de detecção utilizado no DRIT seja semelhante ao IHC, a etapa inicial utiliza tecidos frescos ou congelados para gerar impressões de toque da amostra seguidas de fixação em formalina.
IHC é uma técnica amplamente utilizada para determinar alterações histológicas e detecção de proteínas usando anticorpos específicos em tecidos fixos de formalina embutidos em blocos de parafina. IHC é um teste alternativo estabelecido para a detecção de antígenos da raiva nas seções teciduais7. A IHC tem sido particularmente utilizada para o diagnóstico de casos retrospectivos que apresentaram doenças neurológicas para determinar a carga da raiva8. Tecidos fixos de formalina embutidos em parafina preservam as proteínas para a detecção mesmo após vários anos quando armazenados à temperatura ambiente9. O tratamento formalin modifica as proteínas ao intercruzar e alterar as cadeias laterais de aminoácidos, o que pode tornar os epítoes não mais reativos contra anticorpos10. Embora o teste de IHC para detecção de antígenos da raiva envolva mAbs ou pAbs, este último é vantajoso, pois múltiplos epítopos e lyssavírus divergentes podem ser detectados11.
As etapas padrão envolvidas no IHC são a fixação formalina de tecidos, incorporação em blocos de parafina, secção de tecidos, desparafinação e hidratação, recuperação de epítopes, reatividade contra anticorpos primários e secundários e o desenvolvimento usando substratos cromogênicos. Este manuscrito descreve um relato detalhado do protocolo para diagnóstico de raiva. Para detecção de antígeno da raiva, o soro de camundongos imunizado com RABV (pAbs) gerado nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC) Atlanta, Geórgia, em combinação com anticorpos secundários anti-camundongos biotinilados são utilizados. O Abs biotinilado é detectado pela adição do complexo de peroxidase de rabanete streptavidin-horseradish (HRP), seguido pelo desenvolvimento de cores com substrato de amino-etilcarbazol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

Uma das principais modalidades de diagnóstico para raiva é a detecção do complexo de ribonucleoproteína viral (RNP) nas amostras de tecido infectado. Embora o teste de anticorpos fluorescentes diretos (DFA) ou o teste imunohistoquímico rápido direto (DRIT) sejam mais comumente utilizados para a detecção de antígenos, ambos os testes requerem tecidos frescos e/ou congelados para impressões em lâminas antes da detecção de antígenos usando anticorpos. Se as amostras forem coletadas e fixadas em formalina, nenhum dos testes é ideal para a detecção de antígenos, no entanto, os testes podem ser realizados pela imunohistoquímica convencional (IHC) após a incorporação em blocos de parafina e secção. Com este método IHC, os tecidos são manchados com anticorpos antirraiva, seções são desparafinadas, antígenos recuperados por proteólise parcial ou outros métodos, e incubados com anticorpos primários e secundários. Os antígenos são manchados usando peroxidase de rabanete / amino etil carbazole e contra-manchados com hematoxilina para a visualização usando um microscópio leve. Além da detecção específica de antígenos, a fixação de formalina oferece outras vantagens como a determinação de alterações histológicas, condições relaxadas para armazenamento e transporte de amostras (sob temperaturas ambientes), capacidade de testar casos retrospectivos e maior segurança biológica através da inativação de agentes infecciosos.

A Figura 2 demonstra resultados representativos de coloração do IHC de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais testados. A Figura 2A,D,G representa amostras positivas em 200x, enquanto a Figura 2B,E,H corresponde à ampliação de 400x, respectivamente. Figura 2A-C correspondem ao tro...

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Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.

Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Os tecidos utilizados para a imunohistoquímica e para histopatologia diagnóstica são rotineiramente fixados em formalina tampão de fosfato de 10%. A detecção de antígeno do vírus da raiva no tecido cerebral que foi fixado em formalina apresenta um desafio único, e o teste de IHC foi encontrado como um método sensível e específico para detecção de antígenos do vírus da raiva. A principal vantagem da biópsia ou outros métodos de detecção é que os antígenos podem ser detectados em relação à morfologia tecidual e celular.Com o IHC, a localização do antígeno da raiva nos tecidos cerebrais e não cerebrais, fornece informações adicionais que não poderiam ser obtidas através de seções rotineiras de hematolina e eosina. O teste de diagnóstico da raiva é importante para o início da profilaxia pós-exposição em humanos expostos ao vírus da raiva. IHC é um dos ensaios mais comumente realizados em tecidos fixos de formalina.Com anticorpos específicos, pode ser usado para a detecção de seus respectivos patógenos. Para iniciar este procedimento, coloque de três a cinco milímetros de tecido cerebral, coletado após a necropsia, em uma solução de formalina 10% tamponada por 24 a 72 horas. Regissore o peso aproximado do tecido, o tipo de tecido e o volume de formalina.Coloque os tecidos em 70% de etanol para maior armazenamento de tecido após a fixação da formalina e antes do processamento. Após a fixação do espécime, disseque o tecido para incluir as áreas cerebrais importantes, como seções transversais do tronco cerebral, do cerebelo ou do hipocampo. Cada um, cortado para uma espessura entre três e cinco milímetros.Coloque os tecidos em fitas de processamento. Processe as fitas de tecido para infiltração de cera de parafina. Incorpore-os em blocos de parafina e seque-os em um microtome.Primeiro configure o prato de coloração conforme descrito na Figura 1 do protocolo de texto. Encha cada prato com 250 mililitros da solução preparada. Para preparar a solução de estoque de substrato AEC, use uma pipeta de vidro para dissolver um comprimido de 20 miligramas de AEC em 5 mililitros de N, N-Dimethylformamida.Para preparar a solução de estoque protease, dissolva 7 miligramas da protease em 200 mililitros de PBS. Para preparar o tampão de lavagem, adicione 100 mililitros de Tween 80 a 990 mililitros de PBS, e misture bem para formar uma solução homogênea de PBT-T. Usando um microtome, faça uma seção de 5 micrômetros de parafina.Carregue a seção em um banho de água a 38 graus Celsius e colete-a em lâminas de vidro. Rotule os slides com uma caneta resistente ao reagente. Coloque os slides sobre uma bandeja e derreta em um forno a 55 a 60 graus Celsius por uma hora.Em seguida, retire os slides do forno e desparafina-os imediatamente, usando 3 enxágues consecutivos de xileno de 5 minutos cada. Depois disso, reidratar as seções no slide por imersões sequenciais na diminuição das diluições de etanol para água desionizada, conforme descrito no protocolo de texto. Trate os slides com a protease por 30 minutos para recuperação de antígeno proteolítico, depois enxágue os slides em PBS-T por 10 minutos e trate-os com peróxido de hidrogênio de 3% por 10 minutos.Depois disso, lave os slides novamente com PBS-T por 10 minutos. Para começar, remova um slide do buffer, certificando-se de segurar apenas um slide de cada vez, enquanto os outros permanecem submersos, e use uma toalha de papel para apagar o excesso de tampão ao redor da seção de tecido. Coloque os slides em uma câmara de umidade e incubar com soro de cabra normal à temperatura ambiente por 15 minutos.Em seguida, incubar os slides na câmara de umidade com o anticorpo antirraiva primário de diluição pré-determinada ideal, e anticorpos de controle negativo, em temperatura ambiente por 60 minutos sem lavagens no meio. Depois disso, lave os slides com PBS-T por 10 minutos e incuba em uma câmara de umidade com o anticorpo biotinilado à temperatura ambiente por 15 minutos. Lave os slides novamente com PBS-T por 10 minutos.Incubar os slides e a câmara de umidade com divisão de tiras e complexo HRB em temperatura ambiente por 15 minutos e lavar o PBS-T por 10 minutos. Em seguida, incubar com AEC em uma câmara de umidade à temperatura ambiente por 10 minutos. Lave os slides em água deionizada por 10 minutos e contra-recomponha com hematoxilyn de Gill, diluído de um a dois com água deionizada por dois minutos.Depois disso, enxágue o excesso de hematoxilina enxaguando os slides em água desionizada. Enxágüe os slides na água da torneira de Scott por 30 segundos e lave em água deionizada por 10 minutos. Remova os slides um de cada vez e monte-os com meio de montagem solúvel em água.Em seguida, use um microscópio leve para ler os slides. Neste estudo, um teste de química imunocítica é demonstrado para a detecção de antígeno do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina. Uma química imunocítica representativa resultante de amostras de controle positivas e negativas em diferentes tecidos cerebrais é mostrada aqui, incluindo o tronco cerebral, as células de cerebelo e purkinje, e o hipocampo.A coloração vermelha magenta, que indica o desenvolvimento de cores usando substrato AEC contra o fundo azul contratermído, é devido à reatividade dos anticorpos contra o antígeno da raiva. Um resultado positivo na Imunohistoquímica corresponde à coloração vermelha magenta nas seções teciduais. A coloração de inclusões citoplasmáticas e inclusões granulares de tamanho variado são indicativos de amostras positivas para infecções de RABV.As amostras são consideradas negativas se não forem observadas manchas vermelhas específicas ou apenas o fundo azul, devido à hematoxilina. Além da coloração positiva, a distribuição das inclusões poderia proporcionar quantificação indireta dos níveis de antígeno da raiva na amostra, o que pode corresponder à carga viral da amostra de tecido. Independentemente dos níveis de distribuição, qualquer coloração específica classificará a amostra como positiva para detecção de antígenos RABV.Os tecidos devem ser fixados adequadamente em formalina, e evitar o congelamento dos tecidos durante esse processo. O antígeno da raiva é detectado pelo IHC, então técnicas moleculares podem ser realizadas em seções de parafina para determinar a variante Lyssavirus com base em informações de sequência de RNA. Reagentes como xileno e formalina devem ser manuseados em capuzes de fumaça.Deve-se tomar cuidado ao manusear a AEC, pois é um cancerígeno.

Research

JoVE Journal

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Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

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Diagnóstico da tuberculose pulmonar com o teste Xpert MTB / RIF

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

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Uma nova abordagem para Microdissecção Recuperando<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; transcritos específicos de formalina fixo Parafina incorporado Lung granulomas

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