Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
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Agradecemos a los laboratoristas, epidemiólogos y afiliados de los departamentos de salud pública por las presentaciones de muestras a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Los hallazgos y conclusiones de este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. El uso de nombres comerciales y fuentes comerciales son solo para identificación y no implican el respaldo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

Si bien el protocolo IHC se realizó en tejidos fijos con formalina, que inactiva el RABV si está presente, se deben seguir adecuadamente los protocolos de bioseguridad apropiados. Todos los procedimientos de bioseguridad se describen en la 5ª edición de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado y el requisito de vacunación como se describe12. Ade...

<ol>
	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. 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Debido a la alta tasa de mortalidad de la rabia después del inicio de los síntomas, el diagnóstico de animales sospechosos de infección por RABV es extremadamente crítico para un tratamiento profiláctico adecuado después de la exposición. El diagnóstico de la rabia depende principalmente de técnicas basadas en DFA, DRIT y PCR que utilizan tejidos frescos o congelados. Para las pruebas de tejidos fijos con formalina, la prueba IHC proporciona un método alternativo para la detección sensible y específica del a...

La rabia es una encefalitis progresiva aguda causada por los virus de ARN de sentido negativo pertenecientes al género lyssavirus1. Casi el 99% de todas las muertes humanas causadas por la infección con el virus de la rabia (RABV), el miembro tipo del género, es transmitida por perros2. El diagnóstico de rabia de animales sospechosos se basa en la detección de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viralmente, proteína N) en complejo con ARN genómico (complejo ribonucleoproteína, RNP) en el tejido cerebral3. La detección de antígenos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la rabia4. El método utiliza material cerebral fresco o fresco congelado, una impresión táctil en una diapositiva, fijación en acetona, tinción utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales (mAbs/pAbs) de isotiocianato fluorescente (FITC) disponibles comercialmente y leídos por la microscopía de fluorescencia5. La prueba DFA es rápida, sensible y específica para la detección de antígenos de rabia en tejido cerebral fresco. Recientemente, se demostró que una prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT), técnica de inmunohistoquímica modificada (IHC), exhibe una sensibilidad similar a la DFA, pero ofrece la ventaja de la microscopía de luz para la visualización6. Si bien el método de detección utilizado en DRIT es similar al IHC, el paso inicial utiliza tejidos frescos o congelados para generar impresiones táctiles de la muestra seguidas de fijación en formalina.
IHC es una técnica ampliamente utilizada para determinar cambios histológicos y la detección de proteínas utilizando anticuerpos específicos en tejidos fijos con formalina incrustados en bloques de parafina. IHC es una prueba alternativa establecida para la detección del antígeno de la rabia en las secciones de tejido7. La IHC se ha utilizado particularmente para el diagnóstico de casos retrospectivos que exhibieron enfermedades neurológicas para determinar la carga de la rabia8. Los tejidos fijados en formalina incrustados en parafina preservan las proteínas para la detección incluso después de varios años cuando se almacenan a temperatura ambiente9. El tratamiento con formalina modifica las proteínas mediante la reticulación y alteración de las cadenas laterales de aminoácidos, lo que podría hacer que los epítopos ya no sean reactivos contra los anticuerpos10. Si bien la prueba IHC para la detección de antígenos de rabia involucra mAbs o pAbs, este último es ventajoso ya que se pueden detectar múltiples epítopos y lissavirus divergentes11.
Los pasos estándar involucrados en la IHC son la fijación de formalina de los tejidos, la incrustación en bloques de parafina, la seccionamiento de los tejidos, la desparafinación y la hidratación, la recuperación del epítopo, la reactividad contra los anticuerpos primarios y secundarios, y el desarrollo utilizando sustratos cromogénicos. Este manuscrito describe una descripción detallada del protocolo para el diagnóstico de la rabia. Para la detección de antígenos de la rabia, se utiliza suero de ratón inmunizado con RABV (pAbs) generado en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos en Atlanta, Georgia, en combinación con anticuerpos secundarios biotinilados contra ratones. Los abs biotinilados se detectan mediante la adición del complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) seguido del desarrollo del color con sustrato de amino-etilcarbazol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

Una de las principales modalidades diagnósticas para la rabia es la detección del complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) (antígeno) en las muestras de tejido infectadas. Si bien la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) o la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) se utilizan con mayor frecuencia para la detección de antígenos, ambas pruebas requieren tejidos frescos y / o congelados para impresiones en diapositivas antes de la detección de antígenos con anticuerpos. Si las muestras se recogen y se fijan en formalina, ninguna de las pruebas es óptima para la detección de antígenos, sin embargo, las pruebas se pueden realizar mediante inmunohistoquímica convencional (IHC) después de incrustar en bloques de parafina y seccionamiento. Con este método IHC, los tejidos se tiñen con anticuerpos antirrábicos, las secciones se desparafinan, el antígeno se recupera mediante proteólisis parcial u otros métodos, y se incuba con anticuerpos primarios y secundarios. Los antígenos se tiñen con peroxidasa de rábano picante / amino etil carbazol y se contrateñen con hematoxilina para la visualización utilizando un microscopio de luz. Además de la detección específica de antígenos, la fijación de formalina ofrece otras ventajas como la determinación de cambios histológicos, condiciones relajadas para el almacenamiento y transporte de muestras (bajo temperatura ambiente), capacidad para probar casos retrospectivos y una mayor seguridad biológica a través de la inactivación de agentes infecciosos.

La Figura 2 muestra resultados representativos de tinción de IHC de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales analizados. La Figura 2A, D, G representa muestras positivas a 200x, mientras que la Figura 2B, E, H corresponde a un aumento de 400x, respectivamente. Figura 2A-C corresponden a...

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Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Los tejidos utilizados para la inmunohistoquímica y para la histopatología diagnóstica se fijan rutinariamente en formalina tampón de fosfato al 10%. La detección del antígeno del virus de la rabia en el tejido cerebral que se ha fijado en formalina presenta un desafío único, y se ha encontrado que la prueba IHC es un método sensible y específico para la detección del antígeno del virus de la rabia. La principal ventaja de la biopsia u otros métodos de detección es que los antígenos se pueden detectar en relación con la morfología tisular y celular.Con IHC, la localización del antígeno de la rabia en tejidos cerebrales y no cerebrales, proporciona información adicional que no se pudo obtener a través de las secciones de rutina de tinción de hematoxilina y eosina. Las pruebas de diagnóstico de la rabia son importantes para el inicio de la profilaxis posterior a la exposición en humanos expuestos al virus de la rabia. IHC es uno de los ensayos más comúnmente realizados en tejidos fijos de formalina.Con anticuerpos específicos, se puede utilizar para la detección de patógenos respectivos. Para comenzar este procedimiento, coloque de tres a cinco milímetros de piezas de tejido cerebral, recolectadas después de la necropsia, en una solución de formalina tamponada al 10% durante 24 a 72 horas. Registre el peso aproximado del tejido, el tipo de tejido y el volumen de formalina.Coloque los tejidos en etanol al 70% para un almacenamiento de tejido más largo después de la fijación de formalina y antes del procesamiento. Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas cerebrales importantes, como las secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo o el hipocampo. Cada uno, cortado a un grosor entre tres y cinco milímetros.Coloque los tejidos en casetes de procesamiento. Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina. Incrustarlos en bloques de parafina y seccionarlos en un microtomo.Primero configure el plato de tinción como se describe en la Figura 1 del protocolo de texto. Llene cada plato con 250 mililitros de la solución preparada. Para preparar la solución de caldo de sustrato AEC, use una pipeta de vidrio para disolver una tableta de 20 miligramos de AEC en 5 mililitros de N, N-Dimetilformamida.Para preparar la solución de caldo de proteasa, disuelva 7 miligramos de la proteasa en 200 mililitros de PBS. Para preparar el tampón de enjuague, agregue 100 mililitros de Tween 80 a 990 mililitros de PBS y mezcle bien para formar una solución homogénea de PBT-T. Usando un microtomo, haga una sección de parafina de cinco micrómetros.Cargue la sección en un baño de agua a 38 grados centígrados y recójala en toboganes de vidrio. Etiquete las diapositivas con una pluma resistente a los reactivos. Coloque los toboganes en una bandeja y derrita en un horno a 55 a 60 grados centígrados durante una hora.Luego, retira los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafinarlos, utilizando 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 minutos cada uno. Después de esto, rehidrate las secciones en la diapositiva mediante inmersiones secuenciales en diluciones decrecientes de etanol a agua desionizada, como se describe en el protocolo de texto. Trate los portaobjetos con la proteasa durante 30 minutos para la recuperación del antígeno proteolítico, luego enjuague los portaobjetos en PBS-T durante 10 minutos y trátelos con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos.Después de esto, lave las diapositivas nuevamente con PBS-T durante 10 minutos. Para comenzar, retire una diapositiva del búfer, asegurándose de manejar solo una diapositiva a la vez, mientras las otras permanecen sumergidas, y use una toalla de papel para borrar el exceso de amortiguación de alrededor de la sección de tejido. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad e incube con suero de cabra normal a temperatura ambiente durante 15 minutos.A continuación, incube los portaobjetos en la cámara de humedad con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminado óptimo y anticuerpos de control negativos, a temperatura ambiente durante 60 minutos sin lavados intermedios. Después de esto, lave los portaobjetos con PBS-T durante 10 minutos e incube en una cámara de humedad con el anticuerpo biotinilado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lave los portaobjetos de nuevo con PBS-T durante 10 minutos.Incubar los portaobjetos y la cámara de humedad con división de tiras y complejo HRB a temperatura ambiente durante 15 minutos y lavar el PBS-T durante 10 minutos. Luego, incube con AEC en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lave los portaobjetos en agua desionizada durante 10 minutos y contraconta con hematoxilun de Gill, diluido uno o dos con agua desionizada durante dos minutos.Después de esto, enjuague el exceso de hematoxilina enjuagando los por inmersión los portaobjetos en agua desionizada. Enjuague los toboganes en Scott's Tap Water durante 30 segundos y lávelos en agua desionizada durante 10 minutos. Retire las diapositivas de una en una y móntelas con un medio de montaje soluble en agua.Luego, use un microscopio de luz para leer las diapositivas. En este estudio, se demuestra una prueba de química inmunocítica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina. Aquí se muestra un resultado representativo de tinción química inmunocítica de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales, incluidos el tronco encefálico, el cerebelo y las células de purkinje, y el hipocampo.La tinción de rojo magenta, que indica el desarrollo del color mediante el uso de sustrato AEC contra el fondo azul contramantado, se debe a la reactividad de los anticuerpos contra el antígeno de la rabia. Un resultado positivo en Inmunohistoquímica corresponde a la tinción de color rojo magenta en las secciones de tejido. La tinción de inclusiones citoplasmáticas e inclusiones granulares de tamaño variable son indicativas de muestras positivas para infecciones por RABV.Las muestras se consideran negativas si no se observó ninguna tinción roja específica o solo el fondo azul, debido a la hematoxilina. Además de la tinción positiva, la distribución de las inclusiones podría proporcionar una cuantificación indirecta de los niveles de antígeno antirrábico en la muestra, que podría corresponder a la carga viral de la muestra de tejido. Independientemente de los niveles de distribución, cualquier tinción específica clasificará la muestra como positiva para la detección de antígenos RABV.Los tejidos deben fijarse adecuadamente en formalina y evitar congelar los tejidos durante este proceso. El antígeno de la rabia es detectado por IHC, luego se pueden realizar técnicas moleculares en secciones de parafina para determinar la variante de Lyssavirus basada en la información de la secuencia de ARN. Los reactivos como el xileno y la formalina deben manipularse en campanas extractoras.Se debe tener cuidado al manipular AEC, ya que es un carcinógeno.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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El diagnóstico de tuberculosis pulmonar con el Xpert MTB / RIF prueba

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