Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues at JoVE.com

Laboratuvar uzmanlarına, epidemiyologlara ve halk sağlığı departmanlarına bağlı kuruluşlara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine örnek gönderimler için teşekkür ederiz. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarların bulgularıdır ve mutlaka Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinin resmi konumunu temsil etmez. Ticari isimlerin ve ticari kaynakların kullanımı yalnızca tanımlama içindir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından onay anlamına gelir.

Mevcutsa RABV'yi devre dışı bırakan formalin-sabit dokularda IHC protokolü yapılırken, uygun biyogüvenlik protokollerine uygun şekilde uyulmalıdır. Tüm biyogüvenlik prosedürleri Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) içinde, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymek ve açıklandığı gibi aşılama gereksinimi dahil olmak üzere açıklanmıştır12. Ek olarak, tehlikeli kimyas...

<ol>
	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus:+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles.">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consulation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).</li><li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens.">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li><li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+five+year+(1985-1989)+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies.">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues.">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections.">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li><li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies+prevention--United+States,+2008:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices.">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).</li><li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test.">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses.">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li></ol>

Semptom başlangıcından sonra kuduzun yüksek ölüm oranı nedeniyle, RABV enfeksiyonu için şüpheli hayvanların tanısı uygun bir maruziyet sonrası profilaktik tedavi için son derece kritiktir. Kuduz tanısı öncelikle taze veya dondurulmuş dokular kullanılarak DFA, DRIT ve PCR tabanlı tekniklere bağlıdır. Formalin-sabit dokuların test edilmesi için, IHC testi RABV antijeninin hassas ve spesifik tespiti için alternatif bir yöntem sağlar. Formalin ile sabitlenen dokular çapraz bağlama gibi yan zinc...

Kuduz, lyssavirus cinsine ait negatif duyu RNA virüslerinin neden olduğu akut ilerleyici bir ensefalittir1. Cinsin tip üyesi kuduz virüsü (RABV) enfeksiyonundan kaynaklanan tüm insan ölümlerinin yaklaşık% 99'u köpekler tarafından bulaşır2. Şüpheli hayvanların kuduz tanısı, beyin dokusunda genomik RNA (ribonikoprotein kompleksi, RNP) ile komplekste antijenin (öncelikle viral kodlanmış nükleoprotein, N proteini) tespit edilmesine dayanır3. Doğrudan floresan antikor (DFA) testi ile antijen tespiti kuduz tanısı için altın standart olarak kabul edilir4. Yöntemde taze veya taze dondurulmuş beyin materyali, slayt üzerinde dokunma izlenimi, asetonda fiksasyon, ticari olarak mevcut floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli monoklonal veya poliklonal antikorlar (mAbs/pAbs) kullanılarak boyama ve floresan mikroskopisi tarafından okunur5. DFA testi hızlı, hassas ve taze beyin dokusunda kuduz antijen tespiti için özeldir. Son zamanlarda, doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT), modifiye immünhistokimya (IHC) tekniğinin DFA'ya benzer hassasiyet gösterdiği gösterilmiştir, ancak görselleştirme için ışık mikroskopisi avantajı sunmaktadır6. DRIT'de kullanılan algılama yöntemi IHC'ye benzer olsa da, ilk adımda numunenin dokunma izlenimlerini oluşturmak için taze veya dondurulmuş dokular ve ardından formalin fiksasyonu kullanılır.
IHC, parafin bloklarına gömülü formalin-sabit dokularda spesifik antikorlar kullanarak histolojik değişiklikleri ve proteinlerin tespitini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. IHC, doku bölümlerinde kuduz antijen tespiti için belirlenmiş bir alternatif testtir7. IHC özellikle kuduz yükünü belirlemek için nörolojik hastalıklar sergileyen retrospektif vakaların tanısı için kullanılmıştır8. Parafin gömülü formalin sabit dokular, ortam sıcaklığında depolandığında birkaç yıl sonra bile proteinleri tespit için korur9. Formalin tedavisi, amino asit yan zincirlerini çapraz bağlayarak ve değiştirerek proteinleri değiştirir, bu da epitopların antikorlara karşı artık reaktif olmamasını sağlayabilir10. Kuduz antijen tespiti için IHC testi mAbs veya pAbs içerirken, ikincisi birden fazla epitop ve farklı lyssavirüsler tespit edilebildiğinden avantajlıdır11.
IHC'de yer alan standart adımlar dokuların formalin sabitlenmesi, parafin bloklarına gömülmesi, dokuların bölümlenmesi, deparaffinizasyon ve hidrasyon, epitop iyileşmesi, birincil ve ikincil antikorlara karşı reaktivite ve kromojenik substratlar kullanılarak gelişimdir. Bu makalede kuduz tanısı için protokolün ayrıntılı bir anlatımı açıklanmaktadır. Kuduz antijen tespiti için, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) Atlanta, Georgia'da biyotinillenmiş fare karşıtı ikincil antikorlarla birlikte üretilen RABV (pAbs) ile aşılanmış fare serumu kullanılmaktadır. Biyotinilasyonlu Abs, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) kompleksinin eklenmesi ve ardından amino-etilkarbazol substratı ile renk gelişimi ile tespit edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

Kuduz için birincil tanı yöntemlerinden biri, enfekte doku örneklerinde viral ribonikleoprotein (RNP) kompleksinin (antijen) saptanmasıdır. Antijen tespiti için doğrudan floresan antikor (DFA) testi veya doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT) en yaygın olarak kullanılırken, her iki test de antikorlar kullanılarak antijen tespit edilmeden önce slaytlardaki gösterimler için taze ve/veya dondurulmuş dokular gerektirir. Örnekler formalin içinde toplanır ve sabitlenirse, her iki test de antijen tespiti için uygun değildir, ancak test parafin bloklarına ve kesitlere gömüldikten sonra geleneksel immünhistokimya (IHC) tarafından yapılabilir. Bu IHC yöntemi ile dokular anti-kuduz antikorları ile lekelenir, bölümler deparaffinize edilir, kısmi proteoliz veya diğer yöntemlerle antijen alınır ve primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilir. Antijenler yaban turpu peroksidaz / amino etil karbazol kullanılarak lekelenir ve hafif bir mikroskop kullanılarak görselleştirme için hematoksilin ile karşıtır. Spesifik antijen tespitine ek olarak, formalin fiksasyonu histolojik değişikliklerin belirlenmesi, numune depolama ve taşıma için rahat koşullar (ortam sıcaklıkları altında), retrospektif vakaları test etme yeteneği ve enfeksiyöz ajanların inaktivasyonu yoluyla biyolojik güvenliğin iyileştirilmesi gibi başka avantajlar sunar.

Şekil 2, test edilen farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili IHC boyama sonuçlarını göstermektedir. Şekil 2A,D,G 200x'te pozitif örnekleri temsil ederken, Şekil 2B, E, H sırasıyla 400x büyütmeye karşılık gelir. Şekil 2A-C beyin sapına karşılık gelir; <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues at JoVE.com

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

İmmünohistokimya ve tanısal histopatoloji için kullanılan dokular rutin olarak %10 fosfat tampon formalinine sabitlenir. Beyin dokusunda formalin ile sabitlenmiş kuduz virüsü antijeninin tespiti benzersiz bir zorluk teşkil eder ve IHC testinin kuduz virüsü antijen tespiti için hassas ve spesifik bir yöntem olduğu bulunmuştur. Biyopsi veya diğer tespit yöntemlerinin birincil avantajı, antijenlerin doku ve hücresel morfoloji ile ilişkili olarak tespit edilebilmesidir.IHC ile beyin ve beyin dışı dokularda kuduz antijeninin lokalizasyonu, rutin Hematoksilin ve Eosin leke bölümleri ile elde edilemeyen ek bilgiler sağlar. Kuduz tanı testi, kuduz virüsüne maruz kalan insanlarda maruziyet sonrası profilaksilerin başlatılması için önemlidir. IHC, formalin-sabit dokularda en sık yapılan tahlillerden biridir.Spesifik antikorlarla, ilgili patojenlerin tespiti için kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, nekropsiden sonra toplanan üç ila beş milimetrelik beyin dokusunu 24 ila 72 saat boyunca% 10 tamponlanmış formalin çözeltisine yerleştirin. Yaklaşık doku ağırlığını, doku tipini ve formalin hacmini kaydedin.Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için dokuları% 70 etanol içine yerleştirin. Örnek fiksasyonunu takiben, dokuyu beyin sapının kesitleri, beyincik veya hipokampus gibi önemli beyin bölgelerini içerecek şekilde parçalara ayrıştırın. Her biri, üç ila beş milimetre arasında bir kalınlıkta kesin.Dokuları işleme kasetlerine yerleştirin. Parafin balmumu infiltrasyon için doku kasetlerini işleyin. Onları parafin bloklarına gömün ve bir mikrotom üzerine bölümlere ayırdım.İlk olarak, metin protokolünün Şekil 1'inde belirtildiği gibi boyama kabını ayarlayın. Her yemeği hazırlanan çözeltinin 250 mililitresi ile doldurun. AEC substrat stok çözeltisini hazırlamak için, 20 miligramlık bir AEC tabletini 5 mililitre N, N-Dimetilformamid içinde çözmek için bir cam pipet kullanın.Proteaz stok çözeltisini hazırlamak için, 200 mililitre PBS'de 7 miligram proteaz çözün. Durulama tamponu hazırlamak için 100 mililitre Ara 80 ila 990 mililitre PBS ekleyin ve homojen bir PBT-T çözeltisi oluşturmak için iyice karıştırın. Bir mikrotom kullanarak, beş mikrometre parafin bölümü yapın.Bölümü 38 santigrat derecede bir su banyosuna yükleyin ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalemle etiketleyin. Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve bir saat boyunca 55 ila 60 santigrat derecede bir fırında eritin.Ardından, slaytları fırından çıkarın ve her biri 5 dakikalık 3 ardışık ksilen durulama kullanarak hemen deparaffinize edin. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, etanol seyreltmelerini deiyonize suya indirerek slayttaki bölümleri rehidratlayın. Slaytları proteolitik antijen alımı için 30 dakika boyunca proteazla tedavi edin, ardından slaytları PBS-T'de 10 dakika durulayın ve 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin.Bundan sonra, slaytları PBS-T ile 10 dakika boyunca tekrar yıkayın. Başlamak için, bir slaydı arabellekten çıkarın, diğerleri su altında kalırken aynı anda yalnızca bir slaydı işlediğinizden emin olun ve doku bölümünün etrafındaki fazla arabelleği lekelemek için bir kağıt havlu kullanın. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca normal keçi serumu ile kuluçkaya yatırın.Daha sonra, nem odasındaki slaytları önceden belirlenmiş en uygun seyreltme birincil anti-kuduz antikoru ve negatif kontrol antikorları ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Bundan sonra, slaytları PBS-T ile 10 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında biyotinillenmiş antikor ile bir nem odasında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları PBS-T ile 10 dakika boyunca tekrar yıkayın.Slaytları ve nem haznesini şerit bölmeli ve HRB kompleksini oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya bırakın ve PBS-T'yi 10 dakika yıkayın. Daha sonra, AEC ile oda sıcaklığında bir nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları deiyonize suda 10 dakika yıkayın ve Gill'in Hematoxilyn'i ile karşı çekim yapın, iki dakika boyunca deiyonize su ile bir ila iki kez seyreltin.Bundan sonra, fazla hematoksilinleri deiyonize suya daldırarak durulayın. Slaytları Scott'ın Musluk Suyu'nda 30 saniye durulayın ve 10 dakika deiyonize suda yıkayın. Slaytları teker teker çıkarın ve suda çözünür montaj ortamıyla monte edin.Ardından, slaytları okumak için hafif bir mikroskop kullanın. Bu çalışmada kudurmuş virüs antijeninin formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak saptanması için immünosik kimya testi gösterilmiştir. Beyin sapı, beyincik ve purkinje hücreleri ve hipokampus dahil olmak üzere farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili immünostik kimya lekeleme sonucu burada gösterilmiştir.Mavi karşıt arka plana karşı AEC substratı kullanılarak renk gelişimini gösteren macenta kırmızısı lekelenme, kuduz antijenine karşı antikorların reaktivitesine bağlı. İmmünohistokmiyozda olumlu bir sonuç doku bölümlerindeki macenta kırmızısı lekeye karşılık gelir. Sitoplazmik inklüzyonların ve farklı büyüklükteki granüler inklüzyonların lekelenmeleri RABV enfeksiyonları için pozitif örneklerin göstergesidir.Hematoksilin nedeniyle spesifik kırmızı lekelenme veya sadece mavi arka plan gözlenmediği takdirde numuneler negatif kabul edilir. Pozitif lekelenmeye ek olarak, inklüzyonların dağılımı, örnekteki kuduz antijen seviyelerinin dolaylı olarak nicelleştirilmesini sağlayabilir ve bu da doku örneğinin viral yüküne karşılık gelebilir. Dağılım düzeylerinden bağımsız olarak, herhangi bir özel boyama, numuneyi RABV antijen tespiti için pozitif olarak sınıflandıracaktır.Dokular formalin içinde yeterince sabitlenmeli ve bu işlem sırasında dokuların donmasını önlemelidir. Kuduz antijeni IHC tarafından tespit edilir, daha sonra RNA dizi bilgilerine dayanarak Lyssavirus varyantını belirlemek için parafin bölümlerinde moleküler teknikler yapılabilir. Ksilen ve formalin gibi reaktifler duman kaputlarında ele alınmalıdır.Kanserojen olduğu için AEC ile ilgilenirken dikkatli olunmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Xpert MTB / RIF Testi ile Akciğer Tüberkülozu Tanısı

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Etiket-ücretsiz Biyosensör Teknolojisi kullanılması Meme Kanserinde İnsan Lökosit Antijen BİYOMARKÖRLERİN Algılama

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...