Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

ساندت هذا عمل كان ب ال [دوتش] [فورسسكهنغجيميندسكهفت] ([سالفيس] 670).

تم تنفيذ عزل الضامة من الفئران وفقا لقانون حماية الماشية في ألمانيا وفقا للجنة الأخلاق في جامعه كولونيا.
ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات ارتداء القفازات. تنفيذ جميع الخطوات ترانسكشن تحت غطاء للتدفق الرقائقي لمنع تلوث الخلايا. قبل العمل مع mRNA ، تنظيف جميع الصكوك مثل الم?...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages.">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li><li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

هنا نقدم بروتوكول لنقل كفاءه عاليه من الضامة الاساسيه عاده من الصعب إلى ترنسفكايشن مع في المختبر كتبت mrna. والاهم من ذلك ، فان انتقال الضامة باستخدام هذا البروتوكول لا يحفز موت الخلايا أو ينشط الإشارات التهابيه التي تشير إلى انه لا يتم التعرف علي الكاشف العابر ولا علي مركبات mRNA غير الذاتية....

الضامة هي الخلايا البالعة التي تتخصص في الكشف ، وتناول والميكروبات المهينة ، والخلايا ابوتوتيك والحطام الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فانها تساعد علي تنسق الاستجابات المناعية عن طريق إفراز السايتوكينات والكيميائية وعن طريق تقديم المستضدات إلى خلايا T و B الخلايا. الضامة تلعب أيضا أدوارا هامه في العديد من العمليات الأخرى, مثل التئام الجروح, تصلب الشرايين, التورم والسمنة.
لتكون قادره علي الكشف عن جزيئات غير الذاتي مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) والجزيئات خارج المكان مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة الضرر (DAMPs) ، وقد تم تجهيز الضامة مع مجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRR)1. لسوء الحظ, هذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا ل transfect2 كما الكاشف ترانسفيكشن3 والأحماض النووية المتحولة4,5,6,7 غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل prrs كما غير الذاتي. لهذا السبب ، نقل الضامة باستخدام الأساليب الكيميائية أو الفيزيائية8 عاده ما يؤدي إلى تنشيط الضامة وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار الضام عن طريق الحمم البركانية ، وهو شكل من اشكال الموت المبرمجة الخلية التيتسببت بعد الاعتراف بالأمبير الخلوي النقل البيولوجي للبلاعم باستخدام الفيروسات مثل الفيروسات اللحمية أو لينتيفيروسيس كمتجات غالبا ما يكون أكثر كفاءه ، ولكن بناء هذه النواقل الفيروسيةيستغرق وقتا طويلا ويتطلب السلامة البيولوجية مستوي 2المعدات 10 ،11.
وهكذا ، علي الرغم من ان الضامة هي موضوع البحوث المكثفة ، ويعوق تحليل وظائفها علي المستوي الجزيئي لان واحده من أهم الاداات من البيولوجيا الجزيئية ، والتحول من الحمض النووي يبني للتعبير الخارجية لل البروتينات ، لا ينطبق بالبالكاد. وهذا غالبا ما يجبر الباحثين علي استخدام الضامة مثل خطوط الخلايا بدلا من الضامة حسن النية. وتشمل تطبيقات الحقن بالأحماض النووية التعبير عن الصيغ البروتينية المتحولة أو الموسومة ، والتعبير المفرط عن بروتين معين ، وأعاده التعبير عن البروتين في خلفيه الضربة القاضية والتعبير عن البروتينات من الأنواع الأخرى (مثل , [كري] للالطبيعيه أو مرشده [رنا] و كاس 9 ل يستهدف مورثه ضربه قاضيه).
هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح الانتقال كفاءه عاليه من (عاده من الصعب ترنسفكايشن) الضامة الاوليه ، وهذا هو murine الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (bmdm) مع mrna المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. الأهم من ذلك ، في المختبر كتبت mrna التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول يحتوي علي النيونوسيدس المعدلة التي تحدث بشكل طبيعي 5-ميثيل-CTP والزائفة UTP التي تقلل من والاستمناع وتعزيز الاستقرار4،6،7،12،13. فضلا عن ذلك, ال 5 '-نهايات من ال في مختبره [مرنا] [دفوسفورلتد] بالفوسفاتيز قطبيه ان يمنع اعتراف ب ال [تلاعب-ي] مركبه14,15. هذا يقلل من الاعتراف المناعي الفطري لل في المختبر كتبت mRNA. مع شركائنا سهله لتنفيذ البروتوكول ، ومعدلات التحويل بين 50-65 ٪ (الضامة البريتوني (PM)) و 85 ٪ (BMDM) ويتم التوصل إلى حين ، الأهم من ذلك ، لا يوجد اي السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل ' 1 ' كيف يمكن ان تتولد من الحمض النووي الذي يسكت من الناحية المناعية لنقل العدوى من ثوابت الدنا مثل البلازميدات و (2) اجراء التحويل نفسه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

الضامة هي خلايا الخلية المتخصصة في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ولهذه الغاية ، فهي مجهزه بمجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs). لسوء الحظ ، وهذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا لtransfect كما الكاشف ترانسفيكشن والأحماض النووية المحولة غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل PRRs كما غير الذاتي. ولذلك ، غالبا ما يؤدي التحويل في الضامة التنشيط وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار من الضامة. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح النقل عاليه الكفاءة من الضامة murine الابتدائية مثل الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (BMDM) مع mRNA في المختبر المنقولة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. مع هذا البروتوكول البسيط ، يتم تحقيق معدلات التحويل من حوالي 50-65 ٪ لل PM وحوالي 85 ٪ لشركه BMDM دون السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل جيل mRNA للتحويل من ثوابت الحمض النووي مثل البلازميدات واجراء التحويل.

لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد mRNA الترميز للعلم الموسومة نيمو والمتغيرات IKKβ لتحويل الضامة الاساسيه16. الترميز البلازميدات للعلم--الموسومة من نوع البرية (نيموWT) و C54/347a متحولة نيمو (نيموC54/374a) (انظر جدول المواد) تحتوي بالفعل علي T7...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

الضامة ، وخاصه الضامة الاوليه ، هي تحديا لtransfect لأنها تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ونحن نقدم وصفا للبروتوكول الذي يسمح بالنقل عاليه الكفاءة من الضامة الاوليه مع mRNA المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات.

النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

الدق الإلكترونية لأن الضامة تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير ذاتي ، فهي من الصعب بشكل خاص transfect. نحن نصف بروتوكول الذي يسمح نقل فعالة للغاية من الضامة الأولية مع مرنا ولدت من قوالب الحمض النووي مثل plasmids. والميزة الرئيسية لطريقتنا هي أن يتم تحقيق معدلات عالية من الحمل في غياب أي سمية للخلايا يمكن اكتشافها أو المناعي.إثبات الإجراء سيكون مارك هيرب ما بعددوك من مختبري. تبدأ عن طريق ذوبان جميع مكونات عدة النسخ RNA. دوامة الكواشف لمدة خمس ثوان وتدور عليها لمدة ثانيتين في 2،000 مرات ز، ثم الاحتفاظ بها على الجليد حتى استخدامها.إعداد رد فعل النسخ في المختبر RNA في أنبوب microcentuge 0.5 ميكرولتر وفقا لاتجاهات المخطوطة. دوامة الأنبوب وتدور عليه. ثم احتضانه في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حين خلط في 400 دورة في الدقيقة على خلاط الحرارية.بعد الحضانة ، إضافة اثنين من microliters من DNase أنا مباشرة في مزيج رد الفعل. دوامة وتدور أنبوب أسفل، واحتضان ذلك في خلاط الحرارية لمدة 15 دقيقة أخرى. حجز aliquot اثنين ميكرولتر من المنتج Dnase المعالجة لجل التحكم وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.لتعقيد بوليا، إضافة خمسة ميكرولترات من 10X بوليولا البوليميراز العازلة التفاعل وخمسة microliters من البوليميراز البولي إلى رد فعل Dnase المعالجة. دوامة وتدور أسفل هذا المزيج. ثم احتضانه في خلاط الحرارية لمدة 30 دقيقة.عندما يكون رد الفعل كاملاً، خذ شهادتين ميكرولتر لجل التحكم واخزنه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية. أضف 5-prime dephosphorylation الكواشف مباشرة إلى المنتج الذيل بوليا وفقا لاتجاهات المخطوطة. دوامة وتدور أسفل الأنبوب، واحتضان ذلك في خلاط الحرارية لمدة 30 دقيقة أخرى.اتبع رد فعل dephosphorylation مع حضانة لمدة دقيقتين في 80 درجة مئوية من أجل تسخين phosphatase القطب الجنوبي. ثم تنقية في المختبر نسخ مرنا باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الريبي مخصص. قياس تركيز ونقاء مرنا مائل مع مطياف microvolume.تشغيل هلام agarose denaturing مع aliquots التي تم جمعها سابقا للتحقق من وجود منتج واحد، وطول نسخة صحيحة، ومخلفات بوليا. الاستعداد لtransfection عن طريق إضافة حجم محسوبة مسبقا من المخزن المؤقت مرنا transfection ناقص وحدات التخزين من مُكشف مرنا المُنْوَلِب و الميرنا إلى أنبوب رد فعل. اذيب مخزون الـ MRNA وخلطه بلطف عن طريق التقليب الأنبوبي.ثم أضف حجم مرنا المحسوب مسبقاً إلى أنبوب التفاعل. دوامة وتدور أسفل مزيج التفاعل ومحول مرنا، ثم إضافة الحجم المناسب من مبيد الانفعال مرنا إلى أنبوب مزيج التفاعل. دوامة الأنبوب وتدور عليه.ثم احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه، استبدال الوسط ثقافة من الضامة مع ثقافة دافئة جديدة المتوسطة. بمجرد اكتمال حضانة مزيج transfection ، أضف المزيج إلى آبار الصفيح التي تحتوي على الزبنة المنسدلة وفي دائرة من الخارج إلى منتصف البئر.لضمان التوزيع الموحد لمزيج transfection صخرة بلطف لوحة في اتجاه عمودي وأفقي. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات على الأقل. بعد الحضانة، وتحليل كفاءة transfection مع المجهر الفلوريسنس، تدفق استئصال الدراجات أو مناعي.أهم جزء من هذا الإجراء هو ضمان التوزيع الموحد لمزيج transfection بحيث تحصل على جميع الضامة في اتصال مع نفس الكمية من مرنا. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لإنشاء ترميز MRNA لـ FLAG-TAGGED NEMO و IKK-beta المتغيرات لtransfection من الضامة الأولية. تم التحقق من الحجم الصحيح ومخلفات البوليا من مرنا بواسطة agarose هلام الكهرباء.تم تأكيد كفاءة النقل عن طريق توليد مرنا ترميز GFP وإجراء تحليل تدفق cytometry. وارتفع معدل العدوى إلى جانب كمية مرناً المتحولة، حيث وصل إلى 50 إلى 65٪ لPM و80 إلى 85٪ لـ BMDM. في كل من PM و BMDM، ارتفع مستوى التعبير من EGFP في الخلايا المصابة في الوقت وبطريقة تعتمد على الجرعة.الأهم من ذلك، أكد تحليل اللوودينيوم إيوديميد إيجابية أو الملحق الخامس-الضامة الإيجابية أن الإجراء transfection لم تحفز موت الخلايا اللوائية أو المبرمج. تم تحليل كفاءة نقل mRNAs ترميز الأعلام الموسومة نيمو أو IKK بيتا المتغيرات مع المجهر immunofluorescence. وكانت المعدلات حوالي 60٪ بالنسبة لـ Nemo mRNAs و 55٪ لـ IKK-beta mRNAs.كما تم استخدام هذا البروتوكول لتوليد مرنا ترميز Cre إعادة الكومبيناسي. نقل 400،000 BMDM مع 400 نانوغرام من مرنا إعادة الكومبينيز Cre أدى إلى استنفاد كامل تقريبا من البروتين نيمو بعد 48 ساعة، مما يدل على نقل كفاءة عالية. عدم وجود أي كميات يمكن الكشف عنها من Interleukin 1 بيتا, Interleukin-6 وعامل نخر الورم تشير إلى أن إجراء transfection لا تنشيط الإشارات المضادة للالتهابات.يسمح أسلوبنا البسيط نسبيًا أخيرًا بالتعبير عن البروتينات المتحولة أو الموسومة بكفاءة في الضامة الأولية. وهذا من شأنه أن يزيد إلى حد كبير من تحليل وظائف الضامة على المستوى الجزيئي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...