Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Makrofag isolation fra mus blev udført i overensstemmelse med loven om dyrebeskyttelse i Tyskland i overensstemmelse med den etiske komité ved universitetet i Köln.
Bemærk: Udfør alle trin iført handsker. Udfør alle transfektering trin under en laminar flow hætte for at forhindre kontaminering af cellerne. Før du arbejder med mRNA, rengør alle instrumenter som pipetter og alle overflader med 70% ethanol og/eller et RNAse-nedværdigende overfladeaktivt stof (t...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages.">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li><li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Her præsenterer vi en protokol for højeffektiv transfektering af sædvanligvis svære at transfect primære makro fagter med in vitro transkriberet mRNA. Vigtigere, transfektering af makrofager ved hjælp af denne protokol ikke fremkalde celledød eller aktivere proinflammatorisk signalering indikerer, at hverken transfektering reagens eller transficeret mRNA er anerkendt som non-Self.
Mrna's kvalitet er af afgørende betydning for en vellykket transfektering af makrophages ved hjælp af den...

Makrofager er fagocytiske celler, der specialiserer sig i påvisning, indtagelse og nedværdigende mikrober, apoptotiske celler og cellulære vragrester. Desuden, de bidrager til at orkestrat immunrespons ved at udskilte cytokiner og kemo okiner og ved at præsentere antigener til T-celler og B-celler. Makrofager spiller også vigtige roller i talrige andre processer, såsom sårheling, åreforkalkning, tumor og fedme.
For at kunne detektere ikke-selv molekylære molekyler, såsom patogen-associerede molekyl mønstre (Pjater) og out-of-Place-molekyler såsom skade relaterede molekylære mønstre (DAMPs), er makrofager udstyret med et stort udvalg af mønster genkendelses receptorer (PRR)1. Desværre gør dette også makrofager særligt udfordrende at transficere2 som transfektering reagens3 og transficeret nukleinsyre syrer4,5,6,7 ofte er anerkendt af PRRS som non-Self. Af denne grund resulterer transfektering af makrophager ved hjælp af kemiske eller fysiske metoder8 sædvanligvis i makrofag aktivering og nedbrydning af de transficeret nukleinsyrer eller endda i makrofag selvmord via pyroptose, en form for programmeret lytisk celledød udløst efter anerkendelse af cytosolisk PAMPs/damps såsom DNA eller udenlandsk RNA9. Biologisk transfektering af makrofager ved hjælp af vira såsom adenoviruser eller lentivira som vektorer er ofte mere effektiv, men opførelsen af sådanne virale vektorer er tidskrævende og kræver biosikkerhedsniveau 2 udstyr10,11.
Selv om makrofager er genstand for intensiv forskning, hæmmes analysen af deres funktioner på molekylær niveau, fordi et af de vigtigste værktøjer i molekylær biologi, transfektering af nukleinsyre konstruktioner til eksogen ekspression af proteiner, er næppe anvendelig. Dette tvinger ofte forskerne til at bruge makrofag-lignende cellelinjer frem for bona fide makrofager. Anvendelser for nukleinsyre konstruktions transfektering omfatter ekspression af muterede eller mærkede protein versioner, overekspression af et specifikt protein, protein genekspression i en respektive knockout baggrund og ekspression af proteiner fra andre arter (f. eks. , CRE rekombinase eller guide RNA og Cas9 til målrettet gen-udskæring).
Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for yderst effektiv transfektering (sædvanligvis svær at transfect) primær makrofager, der er murine peritonealdialyse makrofager (PM) og knoglemarv-afledte makrofager (bmdm) med mRNA genereret fra DNA-skabeloner såsom Plasmids. Vigtigere, den in vitro transkriberet mRNA genereret ved hjælp af denne protokol indeholder de naturligt forekommende modificerede Nukleosider 5-methyl-CTP og pseudo-UTP, der reducerer immunogenicitet og øge stabiliteten4,6,7,12,13. Desuden er 5 '-enderne af in vitro transkriberet mRNA defosforyleret af Antarktis fosfatase for at forhindre anerkendelse af riggen-i Complex14,15. Dette minimerer medfødte immun genkendelse af in vitro transkriberet mRNA. Med vores nemme at udføre protokol, er transfektering satser mellem 50-65% (peritoneal makrofager (PM)) og 85% (bmdm) nået, mens, vigtigere, der er ingen cytotoksicitet eller immunogenicitet observeret. Vi beskriver i detaljer (i) hvordan den immunologisk lyddæmpet mRNA for transfektering kan genereres fra DNA-konstruktioner såsom plasmider og (II) selve transfektering procedure.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Makrofager er fagocytiske celler specialiseret i påvisning af molekyler af ikke-selv oprindelse. Til dette formål er de udstyret med et stort udvalg af mønster genkendelses receptorer (PRRs). Desværre gør dette også makrofager særligt udfordrende at transficere som transfektering reagens og transficeret nukleinsyre syrer er ofte anerkendt af PRRS som non-Self. Transfektering medfører derfor ofte makrofagaktivering og nedbrydning af de transficeret nukleinsyrer eller endog selvmord på makrofager. Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for højeffektiv transfektering af murine primær makrofager såsom peritonealdialyse makrofager (PM) og knoglemarv-afledte makrofager (bmdm) med mRNA in vitro transkriberet fra DNA-skabeloner såsom Plasmids. Med denne enkle protokol opnås transfektering på ca. 50-65% for PM og ca. 85% for bmdm uden cytotoksicitet eller immunogenicitet observeret. Vi beskriver i detaljer den generation af mRNA for transfektering fra DNA-konstruktioner som plasmider og transfektering procedure.

Vi har med succes brugt denne protokol til at generere mRNA-kodning for flag-Tagged Nemo og ikkβ varianter for transfektering af primære makrofager16. Plasmider-kodningen for flag-Tagged Wild-type (Nemo WT) og C54/347a mutant Nemo (Nemo C54/374a) (Se tabellen over materialer) indeholder allerede en T7 promotor i den korrekte retning (figur 1a). Således var vi kun nødt til at l...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Makrofager, især primær makrofager, er udfordrende at transficere, da de specialiserer sig i at opdage molekyler af ikke-selv oprindelse. Vi beskriver en protokol, der giver mulighed for yderst effektiv transfektering af primær makrofager med mRNA genereret fra DNA-skabeloner som plasmider.

Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

elektronisk kimen, da makrofager specialiserer sig i at detektere molekyler af ikke-selvoprindelse, er de særligt svære at transfektisere. Vi beskriver en protokol, der muliggør højeffektiv transinfektion af primære makrofager med mRNA genereret fra DNA-skabeloner såsom plasmider. Den største fordel ved vores metode er, at høje transfektionsrater opnås i mangel af påviselig cytotoksicitet eller immunogenicitet.Demonstrere proceduren vil være Marc Herb en postdoc fra mit laboratorium. Begynd med at optø alle komponenter i RNA-transskriptionssættet. Vortex reagenserne i fem sekunder og drej dem ned i to sekunder ved 2.000 gange g, og hold dem derefter på is, indtil de bruges.Forbered in vitro RNA transskriptionsreaktionen i et 0,5-mikroliter mikrocentrifugerør i henhold til manuskriptanvisningerne. Vortex røret og drej det ned. Derefter inkuberes det ved 37 grader Celsius i 30 minutter, mens du blander ved 400 rpm på en termisk mixer.Efter inkubationen tilsættes to mikroliter af DNase I direkte ind i reaktionsblandingen. Vortex og drej røret ned, og inkubere det i den termiske mixer i yderligere 15 minutter. Reserver en to-mikroliter aliquot af Dnase-behandlede produkt til kontrol gel og gemme det på minus 80 grader Celsius.Til polyA tailing tilsættes fem mikroliter af 10X polyA polymerasereaktionsbuffer og fem mikroliter polyA polymerase til den Dnase-behandlede reaktion. Vortex og drej blandingen ned. Derefter inkuberes det i den termiske mixer i 30 minutter.Når reaktionen er færdig, skal du tage en to-mikroliter aliquot for kontrol gel og gemme det på minus 80 grader Celsius. Der tilsættes 5-prime dephosphorylation reagenser direkte til polyA tailed produkt i henhold til manuskriptet retninger. Vortex og drej ned i røret, og inkubere det i den termiske mixer i yderligere 30 minutter.Følg dephosphorylation reaktion med en to-minutters inkubation ved 80 grader Celsius for at opvarme inaktivere Antarktis fosfatase. Rens derefter in vitro transskriberede mRNA ved hjælp af et dedikeret RNA-rensesæt. Mål koncentrationen og renheden af det eluterede mRNA med et mikrovolumsspektrofotometer.Kør en denaturering agarose gel med de tidligere indsamlede aliquots at kontrollere tilstedeværelsen af et enkelt produkt, korrekt udskrift længde, og polyA tailing. Forbered dig til transinfektion ved at tilsætte den forudberegnede mængde mRNA-transinfektionsbuffer minus mængderne af mRNA-transinfektionsreagens og mRNA til et reaktionsrør. Tø mRNA-materielet op og bland det forsigtigt ved at vende røret.Tilsæt derefter den forudberegnede mængde mRNA til reaktionsrøret. Vortex og drej ned reaktionsblandingen og mRNA-transinfektionsreagenset, tilsæt derefter det passende volumen af mRNA-transinfektionsreagenset til reaktionsblandingsrøret. Vortex røret og drej det ned.Derefter inkuberes det ved stuetemperatur i 15 minutter. I mellemtiden erstatte kultur medium af makrofager med frisk varm kultur medium. Når inkubationen af transfektionsblandingen er færdig, tilsættes blandingen til pladeblydene, der indeholder makrofagerne dropwise og i en cirkel udefra til midten af brønden.For at sikre en ensartet fordeling af transfektionsblandingen skal pladen stenes forsigtigt i lodret og vandret retning. Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i mindst seks timer. Efter inkubationen analyseres transfektionseffektiviteten med fluorescensmikroskopi, flowcytometri eller immunoblot.Den vigtigste del af denne procedure er at sikre en ensartet fordeling af transfektionsblandingen, så alle makrofager kommer i kontakt med den samme mængde mRNA. Denne protokol blev med succes brugt til at generere mRNA-kodning FLAG-mærkede NEMO- og IKK-betavarianter til transfektion af primære makrofager. Korrekt størrelse og polyA tailing af mRNA blev verificeret ved agarose gel elektroforese.Transfektionseffektivitet blev bekræftet ved at generere mRNA-kodning af GFP og udføre flowcytometrianalyse. Transfektionsraten steg sammen med mængden af transficeret mRNA og nåede 50 til 65% for PM og 80 til 85% for BMDM. I både PM og BMDM steg ekspressionsniveauet for EGFP i transfekterede celler på en tids- og dosisafhængig måde.Det er vigtigt at analysere propidiumidodidpositiv eller bilags V-positive makrofager, der viste, at transfektionsproceduren ikke medfoerte lytisk eller apoptotisk celledød. Transfektionseffektiviteten af mRNAs-kodnings-FLAG-mærkede Nemo- eller IKK-betavarianter blev analyseret med immunofluorescensmikroskopi. Satserne var omkring 60% for Nemo mRNAs og 55% for IKK-beta mRNAs.Denne protokol blev også brugt til at generere mRNA-kodning Cre recombinase. Transinfektion på 400, 000 BMDM med 400 nanogram Cre recombinase mRNA resulterede i næsten fuldstændig udtømning af Nemo-protein efter 48 timer, hvilket indikerer højeffektiv transinfektion. Fraværet af påviselige mængder af Interleukin 1 beta, Interleukin-6 og tumor nekrose faktor viser, at transfektion procedure ikke aktiverer pro-inflammatorisk signalering.Vores relativt enkle metode gør det endelig muligt effektivt at udtrykke muterede eller mærkede proteiner i primære makrofager. Dette vil i væsentlig grad fremme analysen af makrofagfunktioner på molekylært niveau.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Stærkt Effektiv Transfektion af menneskelige THP-1 makrofager ved nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantificering af Cytosolisk vs. vakuolær<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primære Makrofager af Differential Permeabilisering

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Fagosom Migration og Velocity Målt i Live primære humane makrofager inficeret med HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Lille RNA transfektion i primære humane Th17 Celler af Next Generation Elektroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...