Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

L'isolement des macrophages chez les souris a été effectué conformément à la loi allemande sur la protection des animaux, conformément au Comité d'éthique de l'Université de Cologne.
REMARQUE: Effectuez toutes les étapes en portant des gants. Effectuer toutes les étapes de transfection sous une hotte à débit laminaire pour éviter la contamination des cellules. Avant de travailler avec l'ARNm, nettoyez tous les instruments tels que les pipettes et chaque surface a...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Ici nous présentons un protocole pour la transfection très efficace des macrophages primaires habituellement difficiles-à-transfect avec l'ARNm transcrit in vitro. Fait important, la transfection des macrophages utilisant ce protocole n'induit pas la mort cellulaire ou n'active pas la signalisation proinflammatoire indiquant que ni le réactif transfection ni l'ARNm transfecté ne sont reconnus comme non-auto.
La qualité de l'ARNm est d'une importance capitale pour la transfection réussie...

Les macrophages sont des cellules phagocytiques qui se spécialisent dans la détection, l'ingestion et la dégradation des microbes, des cellules apoptotiques et des débris cellulaires. En outre, ils aident à orchestrer les réponses immunitaires en sécrétant des cytokines et des chemokines et en présentant des antigènes aux lymphocytes T et aux cellules B. Les macrophages jouent également un rôle important dans de nombreux autres processus, tels que la cicatrisation des plaies, l'athérosclérose, la tumorigénèse et l'obésité.
Pour être en mesure de détecter des molécules non autonomes telles que les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et les molécules hors de place telles que les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), les macrophages sont équipés d'un large éventail de récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR)1. Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect2 que le réactif transfection3 et les acides nucléiques transfectés4,5,6,7sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Pour cette raison, la transfection des macrophages utilisant des méthodes chimiques ou physiques8 entraîne généralement l'activation et la dégradation des macrophages des acides nucléiques transfectés ou même dans le suicide par macrophage par pyroptose, une forme de mort cellulaire lytique programmée déclenchée après la reconnaissance des PAMP/DAMP cytosoliques tels que l'ADN ou l'ARN étranger9. La transfection biologique des macrophages à l'aide de virus tels que les adénovirus ou les lentivirus comme vecteurs est souvent plus efficace, mais la construction de tels vecteurs viraux prend beaucoup de temps et nécessite un équipement de niveau 2 de biosécurité10,11.
Ainsi, bien que les macrophages soient l'objet de recherches intensives, l'analyse de leurs fonctions au niveau moléculaire est entravée parce que l'un des outils les plus importants de la biologie moléculaire, la transfection des constructions d'acide nucléique pour l'expression exogène de protéines, n'est guère applicable. Cela oblige souvent les chercheurs à utiliser des lignées cellulaires semblables à des macrophages plutôt que des macrophages de bonne foi. Les applications pour la transfection de construction d'acide nucléique incluent l'expression des versions mutées ou marquées de protéine, la surexpression d'une protéine spécifique, la réexpression de protéine dans un fond askouteux respectif et l'expression des protéines d'autres espèces (par exemple. , Cre recombinase ou guide RNA et Cas9 pour le gène ko ciblé).
Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires (généralement difficiles à transfect), c'est-à-dire les macrophages péritonéaux de la murine (PM) et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) avec l'ARNM généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides. Fait important, l'ARNm transcrit in vitro généré à l'aide de ce protocole contient les nucléosides modifiés naturels 5-méthyl-CTP et pseudo-UTP qui réduisent l'immunogénicité et améliorent la stabilité4,6,7,12,13. En outre, les 5'-extrémités de l'ARNm transcrit in vitro sont déphosphorylées par la phosphatase antarctique pour empêcher la reconnaissance par le complexe RIG-I14,15. Ceci minimise la reconnaissance immunitaire innée de l'ARNm transcrit in vitro. Grâce à notre protocole facile à réaliser, les taux de transfection se siant entre 50 et 65 % (macrophages péritonéaux (PM)) et 85 % (BMDM) sont atteints alors que, ce qui est important, il n'y a pas de cytotoxicité ou d'immunogénicité observée. Nous décrivons en détail (i) comment l'ARNm immunologiquement réduit au silence pour la transfection peut être généré à partir de constructions d'ADN telles que les plasmides et (ii) la procédure de transfection elle-même.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Les macrophages sont des cellules phagocytiques spécialisées dans la détection de molécules non auto-d'origine. À cette fin, ils sont équipés d'un large éventail de récepteurs de reconnaissance de motifs (PrR). Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect que le réactif transfection et les acides nucléiques transfectés sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Par conséquent, la transfection entraîne souvent l'activation et la dégradation des acides nucléiques transfectés ou même le suicide des macrophages. Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires de murine tels que les macrophages péritonéaux (PM) et les macrophages marrow-dérivés de moelle (BMDM) avec ARNm in vitro transcrits des modèles d'ADN tels que des plasmides. Avec ce protocole simple, les taux de transfection d'environ 50-65% pour PM et environ 85% pour BMDM sont réalisés sans cytotoxicité ou immunogénicité observée. Nous décrivons en détail la génération de l'ARNm pour la transfection des constructions d'ADN telles que les plasmides et la procédure de transfection.

Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour générer un codage de l'ARNm pour les variantes NEMO et IKKMD étiquetées FLAG pour la transfection des macrophages primaires16. Les plasmides codants pour FLAG-tagged wild-type (NEMOWT) et C54/347A mutant NEMO (NEMOC54/374A) (voir le tableau des matériaux) contiennent déjà un promoteur T7 dans la bonne orientation (Figure 1A...

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Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Les macrophages, en particulier les macrophages primaires, sont difficiles à transfect car ils se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l'ARNm généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides.

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

carillon électronique Parce que les macrophages se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine, ils sont particulièrement difficiles à transfecter. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l’ARNm généré à partir de modèles d’ADN tels que les plasmides. Le principal avantage de notre méthode est que des taux élevés de transfection sont atteints en l’absence de cytotoxicité ou d’immunogénicité détectable.La démonstration de la procédure sera Marc Herb un postdoc de mon laboratoire. Commencez par décongeler tous les composants du kit de transcription arn. Vortex les reagents pendant cinq secondes et faites-les tourner vers le bas pendant deux secondes à 2000 fois g, puis gardez-les sur la glace jusqu’à utilisation.Préparez la réaction in vitro de transcription d’ARN dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 microliter selon les directions manuscrites. Vortex le tube et tournez-le vers le bas. Puis l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes tout en mélangeant à 400 rpm sur un mélangeur thermique.Après l’incubation, ajouter deux microlitres de DNase I directement dans le mélange de réaction. Vortex et faire tourner le tube vers le bas, et l’incuber dans le mélangeur thermique pendant encore 15 minutes. Réservez un aliquot à deux microlitres du produit traité à l’Adn pour le gel de contrôle et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.Pour le résidus de polyA, ajouter cinq microlitres de tampon de réaction de polymésase de 10X polyA et cinq microlitres de polymésexe polyA à la réaction traitée par dnase. Vortex et faire tourner le mélange. Puis l’incuber dans le mélangeur thermique pendant 30 minutes.Lorsque la réaction est terminée, prendre un aliquot de deux microlitres pour le gel de contrôle et le stocker à moins 80 degrés Celsius. Ajouter des reagents de déphosphorylation à 5 premiers directement au produit à queue polyA selon les instructions manuscrites. Vortex et tourner le tube, et l’incuber dans le mélangeur thermique pendant encore 30 minutes.Suivez la réaction de déphosphorylation avec une incubation de deux minutes à 80 degrés Celsius afin de chauffer l’inactivation de la phosphatase antarctique. Puis purifier l’ARNm transcrit in vitro à l’aide d’un kit de purification dédié à l’ARN. Mesurer la concentration et la pureté de l’ARNm éluqué à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.Exécutez un gel d’agarose dénaturant avec les aliquots précédemment recueillis pour vérifier la présence d’un seul produit, la longueur correcte de transcription, et le suivi de polyA. Préparez-vous à la transfection en ajoutant le volume pré-calculé du tampon de transfection de l’ARNm moins les volumes de réaccfection de l’ARNm et de l’ARNm à un tube de réaction. Décongeler le bouillon d’ARNm et le mélanger délicatement en retournant le tube.Ajoutez ensuite le volume pré-calculé de l’ARNm au tube de réaction. Vortex et faire tourner le mélange de réaction et le réaccfection de transfection de l’ARNm, puis ajouter le volume approprié du réaccfection de l’ARNm au tube de mélange de réaction. Vortex le tube et tournez-le vers le bas.Puis l’incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant ce temps, remplacer le milieu culturel des macrophages par un milieu de culture fraîche et chaude. Une fois l’incubation du mélange de transfection terminée, ajouter le mélange aux puits de plaque contenant les macrophages dans le sens de la goutte et en cercle de l’extérieur au milieu du puits.Pour assurer une distribution uniforme du mélange de transfection, secouez doucement la plaque dans une direction verticale et horizontale. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins six heures. Après l’incubation, analyser l’efficacité de la transfection par microscopie fluorescence, cytométrie d’écoulement ou immunoblot.La partie la plus importante de cette procédure est d’assurer une distribution uniforme du mélange de transfection afin que tous les macrophages entrent en contact avec la même quantité d’ARNm. Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer l’ARNm codant les variantes NEMO et IKK-bêta marquées flag pour la transfection des macrophages primaires. La taille correcte et le suivi de polyA de l’ARNm ont été vérifiés par électrophoresis de gel d’agarose.L’efficacité de transfection a été confirmée en générant l’ARNm codant GFP et en effectuant l’analyse de cytométrie de flux. Le taux de transfection a augmenté avec la quantité d’ARNm transfecté, atteignant 50 à 65 % pour les PM et 80 à 85 % pour le BMDM. Dans pm et BMDM, le niveau d’expression d’EGFP dans les cellules transfected a augmenté d’une manière de temps et de dose-dépendante.Fait important, l’analyse des macrophages propidium iodés positifs ou annexin V-positifs a confirmé que la procédure de transfection n’induise pas la mort cellulaire lytique ou apoptotique. L’efficacité de transfection des mRNAs codant des variantes flag-marquées Nemo ou IKK-bêta ont été analysées avec la microscopie d’immunofluorescence. Les taux étaient d’environ 60 % pour les ARNM de Nemo et de 55 % pour les ARNM IKK-bêta.Ce protocole a également été utilisé pour générer l’ARNm codant Cre recombinase. La transfection de 400 000 BMDM avec 400 nanogrammes d’ARNm cre recombinase a entraîné un épuisement presque complet de la protéine Nemo après 48 heures, ce qui indique une transfection très efficace. L’absence de toutes les quantités détectables d’Interleukin 1 bêta, Interleukin-6 et facteur de nécrose tumorale indiquent que la procédure de transfection n’active pas la signalisation pro-inflammatoire.Notre méthode relativement simple permet enfin d’exprimer efficacement les protéines mutées ou étiquetées dans les macrophages primaires. Cela permettrait de poursuivre considérablement l’analyse des fonctions macrophages au niveau moléculaire.

Research

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