Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

L'isolamento dei macrofafi dai topi è stato eseguito in conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali, in conformità con il Comitato Etico dell'Università di Colonia.
 NOT:</</c0> Eseguire tutti i gradini indossando guanti. Eseguire tutte le fasi di trasfezione sotto un cappuccio a flusso laminare per prevenire la contaminazione delle cellule. Prima di lavorare con l'mRNA, pulire tutti gli strumenti come pipette e ogni superficie con 70% etanolo e/o un surfactant c...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Qui presentiamo un protocollo per la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari solitamente difficili da raggiungere con mRNA tranincato in vitro. È importante sottolineare che la trasfezione dei macrofagi utilizzando questo protocollo non induce la morte cellulare né attiva la segnalazione infiammatoria che indica che né il reagente di trafezione né l'mRNA trascurato sono riconosciuti come non-sé.
La qualità dell'mRNA è di fondamentale importanza per la trasfezione di succes...

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento, l'ingestione e la degradazione di microbi, cellule apoptotiche e detriti cellulari. Inoltre, aiutano a orchestrare le risposte immunitarie secernendo citochine e chemiochine e presentando antigeni alle cellule T e alle cellule B. I macrofagi svolgono anche un ruolo importante in numerosi altri processi, come la guarigione delle ferite, l'aterosclerosi, la tumorigenesi e l'obesità.
Per essere in grado di rilevare molecole non autonome come i modelli molecolari associati ai patogeni (PEN) e le molecole fuori luogo come i modelli molecolari associati ai danni (DAMP), i macrofagi sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)1. Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfect2 come la reagente di trasfezione3 e gli acidi nucleici transfettici4,5,6,7 spesso sono riconosciuti dai PRR come non-sé. Per questo motivo, la trasfezione dei macrofagi utilizzando metodi chimici o fisici8 di solito si traduce nell'attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici transfettati o anche nel suicidio del macrofago tramite piroptosi, una forma di morte programmata delle cellule littiche innescata dopo il riconoscimento di PIS citosolici/DAMP come IL DNA o l'RNA estraneo9. La trasfezione biologica dei macrofagi utilizzando virus come adenovirus o lentivirus poiché i vettori sono spesso più efficienti, ma la costruzione di tali vettori virali richiede molto tempo e richiede il livello di biosicurezza 2 attrezzature10,11.
Così, anche se i macrofagi sono oggetto di un'intensa ricerca, l'analisi delle loro funzioni a livello molecolare è ostacolata perché uno degli strumenti più importanti della biologia molecolare, la trasfezione di costrutti di acido nucleico per l'espressione esogena di proteine, è difficilmente applicabile. Questo spesso costringe i ricercatori a usare linee cellulari simili a macrofagi piuttosto che macrofagi in buona fede. Le applicazioni per la trasfezione di costruzione dell'acido nucleico includono l'espressione di versioni proteiche mutate o marcate, la sovraespressione di una proteina specifica, la rielezione delle proteine in un rispettivo sottofondo knockout e l'espressione di proteine di altre specie (ad esempio, , Cre ricombinante o guida RNA e Cas9 per l'eliminazione mirata del gene).
Qui, descriviamo un protocollo che permette la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari (solitamente difficili da trasfecti), che sono macrofagi peritoneici murini (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA generato da modelli di DNA come plasmidi. È importante sottolineare che l'mRNA trascritto in vitro generato utilizzando questo protocollo contiene i nucleoside modificati naturali 5-metili-CTP e pseudo-UTP che riducono l'immunogenicità e migliorano la stabilità4,6,7,12,13. Inoltre, le 5'estremità dell'mRNA trascritto in vitro sono dephofosrylated da fosforesi antartiche per impedire il riconoscimento da parte del complesso RIG-I14,15. Questo riduce al minimo il riconoscimento immunitario innato dell'mRNA trascritto in vitro. Con il nostro protocollo facile da eseguire, i tassi di trasfezione tra 50-65% (macrofagi peritoneali (PM)) e 85% (BMDM) sono raggiunti mentre, soprattutto, non vi è alcuna citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio (i) come l'mRNA immunologicamente silenziato per la trasfezione può essere generato da costrutti di DNA come plasmidi e (ii) la procedura di trasfezione stessa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

I macrofagi sono cellule fagocitiche specializzate nel rilevamento di molecole di origine non auto. A tal fine, sono dotati di una vasta gamma di recettori di riconoscimento dei pattern (PRR). Purtroppo, questo rende anche i macrofagi particolarmente difficili da trasfecare poiché il reagente di trasfezione e gli acidi nucleici trafetti sono spesso riconosciuti dai PRR come non-sé. Pertanto, la trasfezione spesso si traduce nell'attivazione del macrofago e nella degradazione degli acidi nucleici trafetti o anche nel suicidio dei macrofagi. Qui, descriviamo un protocollo che consente la trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari murini come macrofagi peritoneali (PM) e macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) con mRNA in vitro trascritto da modelli di DNA come plasmidi. Con questo semplice protocollo, i tassi di trasfezione di circa il 50-65% per il PM e circa l'85% per il BMDM sono raggiunti senza citotossicità o immunogenicità osservata. Descriviamo in dettaglio la generazione di mRNA per la trasfezione da costrutti di DNA come plasmidi e la procedura di trasfezione.

Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare la codifica mRNA per le varianti NEMO e IKK per la trasfezione dei macrofagi primari16. La codifica plasmids per il tipo selvaggio con tag FLAG (NEMOWT) e il tipo di mutante C54/347A NEMO (NEMOC54/374A) (si veda la Tabella dei Materiali) contengono già un promotore T7 nell'orientamento corretto ( Figura1A). Così, abb...

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Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

I macrofagi, in particolare i macrofagi primari, sono difficili da trasfecare in quanto sono specializzati nel rilevamento di molecole di origine non auto. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generati da modelli di DNA come i plasmidi.

Trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

chiming elettronico Poiché i macrofagi sono specializzati nel rilevare molecole di origine non auto, sono particolarmente difficili da trasfezionere. Descriviamo un protocollo che consente una trasfezione altamente efficiente dei macrofagi primari con mRNA generato da modelli di DNA come i plasmidi. Il vantaggio principale del nostro metodo è che alti tassi di trasfezione si ottengono in assenza di citotossicità o immunogenicità rilevabili.A dimostrare la procedura sarà Marc Herb un postdoc del mio laboratorio. Inizia scongelando tutti i componenti del kit di trascrizione dell'RNA. Vortice i reagenti per cinque secondi e farli girare verso il basso per due secondi a 2.000 volte g, quindi tenerli sul ghiaccio fino all'uso.Preparare la reazione di trascrizione dell'RNA in vitro in un tubo di microcentrifugo da 0,5 microliter secondo le indicazioni del manoscritto. Vortice il tubo e girarlo verso il basso. Quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti durante la miscelazione a 400 giri/min su un miscelatore termico.Dopo l'incubazione, aggiungere due microlitri di DNasi I direttamente nella miscela di reazione. Vortice e far girare il tubo verso il basso e incubarlo nel miscelatore termico per altri 15 minuti. Riservare un'aliquota a due microliter del prodotto trattato con Dnase per il gel di controllo e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.Per la coda poliA, aggiungere cinque microlitri di tampone di reazione della poliA polimerasi 10X e cinque microlitri di poliA polimerasi alla reazione trattata con Dnase. Vortice e spin down il mix. Quindi incubarlo nel miscelatore termico per 30 minuti.Una volta completata la reazione, prendere un'aliquota a due microliter per il gel di controllo e conservarla a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere reagenti di defosforilazione a 5 primi direttamente al prodotto coda poliA secondo le indicazioni del manoscritto. Vortice e girare lungo il tubo e incubarlo nel miscelatore termico per altri 30 minuti.Seguire la reazione di defosforilazione con un'incubazione di due minuti a 80 gradi Celsius per inattivare termicamente la fosfatasi antartica. Quindi purificare l'mRNA trascritto in vitro utilizzando un kit di purificazione dell'RNA dedicato. Misurare la concentrazione e la purezza dell'mRNA eluitato con uno spettrofotometro a microvolume.Eseguire un gel di agarosio denaturante con le aliquote raccolte in precedenza per verificare la presenza di un singolo prodotto, la corretta lunghezza della trascrizione e la coda in poliA. Prepararsi per la trasfezione aggiungendo il volume pre-calcolato del buffer di trasfezione dell'mRNA meno i volumi di reagente di trasfezione dell'mRNA e l'mRNA a un tubo di reazione. Scongelare il materiale mRNA e mescolarlo delicatamente capovolgendo il tubo.Quindi aggiungere il volume pre-calcolato di mRNA al tubo di reazione. Vortice e spin verso il basso la miscela di reazione e il reagente di trasfezione dell'mRNA, quindi aggiungere il volume appropriato del reagente di trasfezione dell'mRNA al tubo di miscela di reazione. Vortice il tubo e girarlo verso il basso.Quindi incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti. Nel frattempo, sostituire il mezzo di coltura dei macrofagi con un mezzo di coltura caldo fresco. Una volta completata l'incubazione della miscela di trasfezione, aggiungere il mix ai pozzali di piastra contenenti i macrofagi dropwise e in un cerchio dall'esterno al centro del pozzo.Per garantire una distribuzione uniforme del mix di trasfezione scuotere delicatamente la piastra in direzione verticale e orizzontale. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno sei ore. Dopo l'incubazione, analizzare l'efficienza di trasfezione con microscopia a fluorescenza, citometria del flusso o immunoblot.La parte più importante di questa procedura è garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione in modo che tutti i macrofagi vengono a contatto con la stessa quantità di mRNA. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per generare varianti NEMO e IKK-beta con tag mRNA per la trasfezione dei macrofagi primari. Le dimensioni corrette e la coda in poliA dell'mRNA sono state verificate dall'elettroforesi del gel di agarosio.L'efficienza della trasfezione è stata confermata generando la codifica dell'mRNA GFP ed eseguendo l'analisi della citometria del flusso. Il tasso di trasfezione è aumentato insieme alla quantità di mRNA trasfetto, raggiungendo il 50-65% per pm e l'80-85% per BMDM. Sia in PM che in BMDM, il livello di espressione di EGFP nelle cellule trasfette è aumentato in modo dipendente dal tempo e dalla dose.È importante sottolineare che l'analisi dei macrofagi propidi-positivi allo ioduro o dell'allegato IV-positivo ha confermato che la procedura di trasfezione non ha provocato la morte cellulare litica o apoptotica. L'efficienza di trasfezione degli mRNA che codificano le varianti Nemo o IKK-beta con tag FLAG sono state analizzate con microscopia ad immunofluorescenza. Le tariffe erano di circa il 60% per gli mRNA Nemo e del 55% per gli MRNA IKK-beta.Questo protocollo è stato utilizzato anche per generare la codifica mRNA Cre recombinase. La trasfezione di 400.000 BMDM con 400 nanogrammi di mRNA cre ricombinasi ha comportato un esaurimento quasi completo della proteina Nemo dopo 48 ore, indicando una trasfezione altamente efficiente. L'assenza di quantità rilevabili di Interleuchina 1 beta, Interleuchina-6 e fattore di necrosi tumorale indicano che la procedura di trasfezione non attiva la segnalazione pro-infiammatoria.Il nostro metodo relativamente semplice consente infine di esprimere in modo efficiente proteine mutate o taggate nei macrofagi primari. Ciò promuoverebbe sostanzialmente l'analisi delle funzioni del macrofago a livello molecolare.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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