Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
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この作品はドイツ・フォルシュチュングゲマイインシャフト(SFB 670)によって支えられた。

マウスからのマクロファージ分離は、ケルン大学の倫理委員会に準拠してドイツ動物保護法に従って行われた。
注:手袋を着用してすべてのステップを実行します。細胞の汚染を防ぐために、層流フードの下ですべてのトランスフェクションステップを実行します。mRNAを使用する前に、ピペットやすべての表面などのすべての機器を70%エタノールおよび/また...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

ここでは、インビトロ転写mRNAを用いた通常はトランスフェクト性の高い一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションのためのプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルを用いたマクロファージのトランスフェクションは、細胞死を誘導したり、トランスフェクション試薬もトランスフェクトされたmRNAも非自己として認識されていないことを示す炎症シグナル伝?...

マクロファージは、微生物、アポトーシス細胞、細胞破片の検出、摂取、分解に特化した貪食細胞です。さらに、サイトカインやケモカインを分泌し、T細胞やB細胞に抗原を提示することで免疫応答を調整するのに役立ちます。マクロファージはまた、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍形成および肥満のような他の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たす。
病原体関連分子パターン(PAMP)や損傷関連分子パターン(DamP)などの場外分子などの非自己分子を検出できるように、マクロファージは、大きなパターン認識受容体(PRR)1を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬3およびトランスフェクト核酸4、5、6、7としてトランスフェクト2に特に困難なマクロファージを作り、多くの場合、PrRによって非自己として認識される。このため、化学的または物理的方法8を用いたマクロファージのトランスフェクションは、通常、トランスフェクトされた核酸のマクロファージ活性化および分解、あるいはピロ球症を介したマクロファージ自殺においても、DNAまたは外来RNA9などのサイトソリックPamPs/Dammpの認識後に引き起こされるプログラムされた溶解細胞死の形態をもたらす。アデノウイルスやレンチウイルスなどのウイルスをベクターとして用いたマクロファージの生物学的トランスフェクションは、より効率的であることが多いが、そのようなウイルスベクターの構築には時間がかかり、バイオセーフティレベル2装置10、11を必要とする。
したがって、マクロファージは集中的な研究の対象であるが、分子生物学の最も重要なツールの一つである、発出性発現のための核酸構築物のトランスフェクションにより、分子レベルにおけるその機能の解析が妨げられる。タンパク質は、ほとんど適用できない。これはしばしば、研究者がボナ・フィデス・マクロファージではなくマクロファージ様細胞株を使用することを強制する。核酸構築トランスフェクションのアプリケーションには、変異またはタグ付けされたタンパク質バージョンの発現、特定のタンパク質の過剰発現、それぞれのノックアウトバックグラウンドでのタンパク質再発現および他の種からのタンパク質の発現(例えば.、クレリコンゲナーゼまたはガイドRNAおよびCas9を標的遺伝子ノックアウト用)。
ここでは、プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いたマウス腹蓋マクロファージ(PM)および骨髄由来マクロファージ(BMDM)である一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。重要なことに、このプロトコルを用いて生成されたインビトロ転写mRNAには、免疫原性を低下させ、安定性を高める天然の修飾ヌクレオシド5-メチル-CTPおよび擬似UTPが含まれており、安定性を高める4、6、7、12、13である。また、インビトロ転写mRNAの5'末端は、RIG-I複合体14、15による認識を防止するために南極ホスファターゼによって脱リン酸化される。これは、インビトロ転写mRNAの自然免疫認識を最小限に抑える。プロトコルを実行しやすいので、トランスフェクション率は50~65%(腹蓋マクロファージ(PM))~85%(BMDM)に達し、重要なことに、細胞傷害性や免疫原性は認められません。(i)トランスフェクション用の免疫学的に沈黙したmRNAが、プラスミドや(ii)トランスフェクション手順そのものなどのDNA構築物からどのように生成できるかを詳しく説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化した貪食細胞です。この用に、それらはパターン認識受容体(PRR)の大きな配列を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬としてトランスフェクトに特に困難なマクロファージを作り、トランスフェクトされた核酸は、多くの場合、非自己としてPRRによって認識されます。したがって、トランスフェクションは、多くの場合、トランスファージの活性化とトランスフェクション核酸の分解、あるいはマクロファージの自殺をもたらす。ここでは、腹腹マクロファージ(PM)や骨髄由来マクロファージ(BMDM)などのマウス一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルを、プラスミドなどのDNAテンプレートから転写したmRNAを用いて説明する。この単純なプロトコルを使用すると、PMのトランスフェクション率は約50〜65%、BMDMのトランスフェクション率は、細胞傷害性または免疫原性が観察されずに達成される。プラスミドなどのDNA構築物からのトランスフェクションのためのmRNAの生成とトランスフェクション手順について詳しく説明する。

このプロトコルを使用して、FLAG タグ付き NEMO および IKKβ バリアントの mRNA エンコーディングを生成し、一次マクロファージ16をトランスフェクションしました。FLAG タグ付きワイルドタイプ (NEMOWT)および C54/347A 変異型 NEMO (NEMOC54/374A)のプラスミドエンコーディング (材料表を参照) には、正しい向きの T7 プロモータが既?...

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Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

電子チャイミング マクロファージは非自己起源の分子を検出することに特化しているため、特にトランスフェクトが困難です。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いて、一次マクロファージのトランスフェクションを高効率に行えるプロトコルについて説明する。我々の方法の主な利点は、高いトランスフェクション率が検出可能な細胞毒性または免疫原性の不在で達成されるということです。手順を実証することは、私の研究室からのポスドクであるマーク・ハーブになります。まず、RNA転写キットのすべての成分を解凍します。試薬を5秒間ボルテックスし、2,000回gで2秒間回転させ、使用するまで氷の上に置きます。原稿の指示に従って0.5マイクロ遠心チューブでインビトロRNA転写反応を準備します。チューブを渦し、それを回転させます。その後、サーマルミキサーで400rpmで混合しながら、30分間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション後、DNase Iの2マイクロリットルを直接反応ミックスに加えます。ボルテックスを回転させ、チューブを下に回転させ、サーマルミキサーでさらに15分間インキュベートします。コントロールジェル用のDNA処理製品の2マイクロリットルのアリコートを予約し、マイナス80°Cで保存します。ポリAテーリングの場合、10Xポリポリメラーゼ反応バッファーの5マイクロリットルとポリAポリメラーゼの5マイクロリットルをDNA処理反応に加えます。渦とミックスをスピンダウン。その後、サーマルミキサーで30分間インキュベートします。反応が完了したら、コントロールジェルに2マイクロリットルのアリコートを取り、マイナス80°Cで保存します。5素分脱リン酸化試薬を原稿の指示に従ってポリA尾製品に直接加えます。ボルテックスをスピンダウンし、さらに30分間サーマルミキサーでインキュベートします。南極ホスファターゼを不活性化するために、80°Cで2分間のインキュベーションで脱リン酸化反応に従ってください。次に、専用のRNA精製キットを使用して、インビトロ転写mRNAを精製します。マイクロボリューム分光光度計で溶出したmRNAの濃度と純度を測定します。以前に収集したアリコートを使用して変性アガロースゲルを実行し、単一の製品、正しい転写長、およびポリAテーリングの存在を確認します。mRNA トランスフェクション バッファーの事前に計算された量から mRNA トランスフェクション試薬の量を差し引いた量と mRNA を反応チューブに加えてトランスフェクションの準備をします。mRNAストックを解凍し、チューブを反転して穏やかに混ぜます。次に、事前に計算されたmRNAの体積を反応管に加えます。ボルテックスとmRNAトランスフェクション試薬との反応ミックスをスピンダウンし、次いでmRNAトランスフェクション試薬の適切な量を反応ミックスチューブに加える。チューブを渦し、それを回転させます。その後、室温で15分間インキュベートします。一方、マクロファージの培養培地を新鮮な温かい培地に置き換える。トランスフェクションミックスのインキュベーションが完了したら、マクロファージを含むプレートウェルにミックスを加え、外側から井戸の真ん中まで円で入れ加えます。トランスフェクションミックスの均一な分布を確保するために、プレートを垂直方向および水平方向にそっと揺らします。その後、プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を少なくとも6時間インキュベートします。インキュベーション後、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはイムノブロットでトランスフェクション効率を分析します。この手順の最も重要な部分は、すべてのマクロファージが同じ量のmRNAと接触するようにトランスフェクションミックスの均一な分布を確保することです。このプロトコルは、一次マクロファージのトランスフェクションのためのFLAGタグ付きNEMOおよびIKK-β変異体をコードするmRNAを生成するために正常に使用されました。mRNAの正しいサイズおよびポリAテーリングはアガロースゲル電気泳動によって検証された。GFPをコードするmRNAを生成し、フローサイトメトリー解析を行うことでトランスフェクション効率を確認した。トランスフェクション速度はトランスフェクションmRNAの量とともに増加し、PMでは50~65%、BMDMでは80~85%に達した。PMおよびBMDMの両方において、トランスフェクトされた細胞におけるEGFPの発現レベルは、時間および用量依存的に増加した。重要なことに、ヨウ化プロピジウム陽性またはアネキシンV陽性マクロファージの分析は、トランスフェクション手順が溶菌またはアポトーシス細胞死を誘発していないことを確認した。FLAGタグ付きニモまたはIKK-β変異体をコードするmRNAのトランスフェクション効率を免疫蛍光顕微鏡で分析した。ニモmRNAの割合は約60%、IKK-βmRNAでは55%であった。このプロトコルは、CreリコンビナーゼをコードするmRNAを生成するためにも使用された。400ナノグラムのCreリコンビナーゼmRNAを用いた400,000 BMDMのトランスフェクションは、48時間後にニモタンパク質のほぼ完全な枯渇をもたらし、非常に効率的なトランスフェクションを示した。インターロイキン1ベータ、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子の検出可能な量の不在は、トランスフェクション手順が炎症促進シグナルを活性化しないことを示す。我々の比較的単純な方法により、最終的に原発マクロファージで変異タンパク質またはタグ付きタンパク質を効率的に発現させることができます。これにより、分子レベルでマクロファージ機能の解析が実質的に進んでいくだろう。

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細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...