Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Macrophage isolasjon fra mus ble utført i samsvar med Dyrevern loven i Tyskland i samsvar med etikk komité ved Universitetet i Köln.
Merk: Utfør alle trinnene iført hansker. Utfør alle transfeksjoner trinnene under en laminær strømnings hette for å hindre kontaminering av cellene. Før du arbeider med mRNA, rengjør du alle instrumenter som Pipetter og alle overflater med 70% etanol og/eller et RNAse overflateaktivt middel (tabell med materialer). Sø...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages.">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li><li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Her presenterer vi en protokoll for svært effektiv transfeksjoner av vanligvis hard-til-transfect primære makrofager med in vitro skrives mRNA. Viktigere, transfeksjoner av makrofager bruker denne protokollen ikke induserer celle død eller aktivere proinflammatoriske signalering som indikerer at verken transfeksjoner reagens eller transfekterte mRNA er anerkjent som ikke-selv.
Kvaliteten på mRNA er av avgjørende betydning for vellykket transfeksjoner av makrofager som bruker denne protoko...

Makrofager er phagocytic celler som spesialiserer seg på å oppdage, inntak og nedverdigende mikrober, apoptotisk celler og cellulære rusk. Videre bidrar de til å organisere immunresponser ved sekresjon cytokiner og chemokiner og ved å presentere antigener til T-celler og B-celler. Makrofager spiller også viktige roller i en rekke andre prosesser, slik som sår helbredelse, aterosklerose, tumorigenesis og fedme.
For å kunne oppdage ikke-selv molekyler som patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs) og out-of-Place molekyler som skade-forbundet molekylære mønstre (demper), makrofager er utstyrt med et stort utvalg av mønster anerkjennelse reseptorer (PRR)1. Dessverre, dette gjør også makrofager spesielt utfordrende å transfect2 som transfeksjoner reagens3 og transfekterte nukleinsyre syrer4,5,6,7 ofte er anerkjent av PRRs som ikke-selv. Av denne grunn, transfeksjoner av makrofager bruker kjemiske eller fysiske metoder8 vanligvis resulterer i macrophage aktivering og degradering av transfekterte nukleinsyre syrer eller selv i macrophage selvmord via pyroptosis, en form for programmert lytisk celle død utløst etter anerkjennelse av cytosolic PAMPs/DEMPER som DNA eller utenlandsk RNA9. Biologiske transfeksjoner av makrofager bruker virus som adenoviruses eller lentiviruses som vektorer er ofte mer effektiv, men byggingen av slike viral vektorer er tidkrevende og krever biosafety nivå 2 utstyr10,11.
Selv om makrofager er gjenstand for intensiv forskning, er analyse av deres funksjoner på molekylnivå hemmet fordi en av de viktigste verktøyene for molekylærbiologi, transfeksjoner av nukleinsyre yre konstruksjoner for eksogene uttrykk for proteiner, er neppe aktuelt. Dette tvinger ofte forskere til å bruke macrophage-lignende cellelinjer snarere enn bona fide makrofager. Søknader om nukleinsyre yre konstruere transfeksjoner inkluderer uttrykk for muterte eller merkede protein versjoner, overuttrykte av et bestemt protein, protein re-uttrykk i en respektive knockout bakgrunn og uttrykk for proteiner fra andre arter (f. eks , Grobunn recombinase eller guide RNA og Cas9 for målrettet gen knockout).
Her beskriver vi en protokoll som gir svært effektiv transfeksjoner av (vanligvis vanskelig å transfect) primære makrofager, som er murine i bukhulen (PM) og benmarg-avledet makrofager (BMDM) med mRNA generert fra DNA-maler som plasmider. Viktigst, in vitro transkribere mRNA generert ved hjelp av denne protokollen inneholder naturlig forekommende modifisert nucleosides 5-metyl-CTP og pseudo-UTP som reduserer immunogenisitet og forbedre stabiliteten4,6,7,12,13. Dessuten blir 5 '-endene av in vitro-mRNA dephosphorylated av Antarktis fosfatase for å forhindre anerkjennelse av riggen-i kompleks14,15. Dette minimerer medfødt uimottakelig anerkjennelse av in vitro skrives mRNA. Med vår lett å utføre protokollen, transfeksjoner priser mellom 50-65% (bukhulen makrofager (PM)) og 85% (BMDM) er nådd stund, viktigere, det er ingen cytotoksisitet eller immunogenisitet observert. Vi beskriver i detalj (i) hvordan immunologisk taushet mRNA for transfeksjoner kan genereres fra DNA-konstruksjoner som plasmider og (II) transfeksjoner prosedyren selv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Makrofager er phagocytic celler spesialisert i å oppdage molekyler av ikke-selv opprinnelse. For dette formål, de er utstyrt med et stort utvalg av mønster anerkjennelse reseptorer (PRRs). Dessverre gjør dette også makrofager spesielt utfordrende å transfect som transfeksjoner reagens og transfekterte nukleinsyre syrer er ofte anerkjent av PRRs som ikke-selv. Derfor transfeksjoner ofte resulterer i macrophage aktivering og degradering av transfekterte nukleinsyre syrer eller selv i selvmord av makrofager. Her beskriver vi en protokoll som gir svært effektiv transfeksjoner av murine primære makrofager som bukhulen (PM) og benmarg avledede makrofager (BMDM) med mRNA in vitro som kan skrives ut fra DNA-maler som plasmider. Med denne enkle protokollen, transfeksjoner priser på ca 50-65% for PM og ca 85% for BMDM oppnås uten cytotoksisitet eller immunogenisitet observert. Vi beskriver i detalj generering av mRNA for transfeksjoner fra DNA-konstruksjoner som plasmider og transfeksjoner prosedyren.

Vi har med hell brukt denne protokollen til å generere mRNA-koding for FLAG-Tagged NEMO og IKKβ varianter for transfeksjoner av primære makrofager16. Plasmider koding for FLAG-Tagged Wild-type (NEMOWT) og C54/347A mutant NEMO (NemoC54/374A) (se tabell over materialer) inneholder allerede en T7 Promotor i riktig retning (figur 1a). Således, vi bare måtte linearize den plasmide...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Makrofager, spesielt primære makrofager, er utfordrende å transfect som de spesialiserer seg på å oppdage molekyler av ikke-selv opprinnelse. Vi beskriver en protokoll som gir svært effektiv transfeksjoner av primære makrofager med mRNA generert fra DNA-maler som plasmider.

Svært effektiv Transfeksjoner av primær makrofager med in vitro skrives mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

elektronisk chiming Fordi makrofager spesialiserer seg på å oppdage molekyler av ikke-selvopprinnelse, er de spesielt vanskelige å transfisere. Vi beskriver en protokoll som muliggjør svært effektiv transfeksjon av primære makrofager med mRNA generert fra DNA-maler som plasmider. Den største fordelen med vår metode er at høye transfection priser oppnås i fravær av noen påviselig cytotoksisitet eller immunogenitet.Å demonstrere prosedyren vil være Marc Herb en postdoktor fra laboratoriet mitt. Begynn med å tine alle komponentene i RNA-transkripsjonssettet. Vortex reagensene i fem sekunder og spinn dem ned i to sekunder ved 2, 000 ganger g, og hold dem deretter på is til bruk.Forbered in vitro RNA transkripsjonsreaksjonen i et 0,5-mikroliter mikrocentrifugerør i henhold til manuskriptets retninger. Vortex røret og spinne det ned. Deretter inkubere den ved 37 grader Celsius i 30 minutter mens du blander ved 400 rpm på en termisk mikser.Etter inkubasjonen, legg til to mikroliter dnase jeg direkte inn i reaksjonsblandingen. Vortex og spinn røret ned, og inkuber det i den termiske mikseren i ytterligere 15 minutter. Reserver en to-mikroliter aliquot av dnase-behandlet produkt for kontrollgelen og lagre det på minus 80 grader Celsius.For polyA tailing, tilsett fem mikroliter av 10X polyA polymerase reaksjonsbuffer og fem mikroliter polyA polymerase til dnase-behandlet reaksjon. Vortex og spinne ned blandingen. Inkuber den deretter i den termiske mikseren i 30 minutter.Når reaksjonen er fullført, ta en to-mikroliter aliquot for kontrollgelen og lagre den på minus 80 grader Celsius. Tilsett 5-prime defosforyleringsreagenser direkte til polyA tailed produktet i henhold til manuskriptet retninger. Vortex og spinn ned røret, og inkuber den i den termiske mikseren i ytterligere 30 minutter.Følg defosforyleringsreaksjonen med en to minutters inkubasjon på 80 grader Celsius for å varme inaktivere den antarktiske fosfatasen. Deretter renser in vitro transkribert mRNA ved hjelp av et dedikert RNA-rensesett. Mål konsentrasjonen og renheten til den eluterte mRNA med et mikrovolumspektrofotometer.Kjør en denaturing agarose gel med tidligere innsamlede aliquots for å bekrefte tilstedeværelsen av et enkelt produkt, riktig transkripsjon lengde, og polyA tailing. Forbered deg på transfeksjon ved å legge det forhåndsberegnede volumet av mRNA-transfeksjonsbufferen minus volumene av mRNA-transfeksjonsreagens og mRNA til et reaksjonsrør. Tin mRNA-aksjen og bland den forsiktig ved å vende røret.Tilsett deretter det forhåndsberegnede volumet av mRNA i reaksjonsrøret. Vortex og spinne ned reaksjonsblandingen og mRNA-transfeksjonsreagensen, og tilsett deretter riktig volum av mRNA-transfiseringsreagensen til reaksjonsblandingsrøret. Vortex røret og spinne det ned.Deretter inkubere den ved romtemperatur i 15 minutter. I mellomtiden erstatter du kulturmediet til makrofagene med friskt varmt kulturmedium. Når inkubasjonen av transfeksjonsblandingen er fullført, legg blandingen til platebrønnene som inneholder makrofagene, dropwise og i en sirkel fra utsiden til midten av brønnen.For å sikre jevn fordeling av transfection bland forsiktig rock platen i en vertikal og horisontal retning. Deretter inkubere platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i minst seks timer. Etter inkubasjonen, analyser transfeksjonseffektivitet med fluorescensmikroskopi, strømningscytometri eller immunoblot.Den viktigste delen av denne prosedyren er å sikre jevn fordeling av transfection blandingen slik at alle makrofager komme i kontakt med samme mengde mRNA. Denne protokollen ble brukt til å generere mRNA-koding FLAG-merket NEMO og IKK-beta varianter for transfection av primære makrofager. Riktig størrelse og polyA tailing av mRNA ble verifisert av agarose gel elektroforese.Transfection effektivitet ble bekreftet ved å generere mRNA koding GFP og utføre flyt cytometri analyse. Transfection rate økt sammen med mengden av trans infisert mRNA, nå 50 til 65%for PM og 80 til 85% for BMDM. I både PM og BMDM økte uttrykksnivået for EGFP i trans infiserte celler på en tid og doseavhengig måte.Viktigere, analyse av propidiumjodid-positive eller Annexin V-positive makrofager bekreftet at transfection prosedyren ikke indusere lytisk eller apoptotisk celle død. Transfection effektivitet av mRNAs koding FLAG-merket Nemo eller IKK-beta varianter ble analysert med immunofluorescence mikroskopi. Prisene var ca 60%for Nemo mRNAs og 55%for IKK-beta mRNAs.Denne protokollen ble også brukt til å generere mRNA koding Cre recombinase. Transfection av 400 000 BMDM med 400 nanogram Cre rekombiner mRNA resulterte i nesten fullstendig uttømming av Nemo protein etter 48 timer, noe som indikerer svært effektiv transfection. Fraværet av noen påvisbare mengder Interleukin 1 beta, Interleukin-6 og tumornekrosefaktor indikerer at transinfeksjonsprosedyren ikke aktiverer pro-inflammatorisk signalisering.Vår relativt enkle metode gjør det endelig mulig å effektivt uttrykke muterte eller merkede proteiner i primære makrofager. Dette vil vesentlig fremme analysen av makrofagfunksjoner på molekylært nivå.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Svært effektiv Transfeksjon menneskerettighets THP-1 Makrofager av nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifisering av cytosolisk vs. vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; I Primær Makrofager av Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Phagosome Migrasjon og Velocity Målt i live primære humane makrofager infisert med HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Liten RNA Transfeksjon i Primær Menneskelig Th17 celler av Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...