Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Макрофаг изоляция от мышей была проведена в соответствии с Законом германии о защите животных в соответствии с Комитетом по этике Кельнского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняй все ступени в перчатках. Выполняй все этапы трансфекции под ламинарным капотом для п...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages.">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li><li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Здесь мы представляем протокол для высокоэффективного трансфекции обычно труднопередаваемых первичных макрофагов с транскрибированной мРНК in vitro. Важно отметить, что трансфекция макрофагов с помощью этого протокола не вызывает гибель клеток и не активирует провоспалительные сигнал...

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, которые специализируются на обнаружении, глотании и деградации микробов, апоптотарных клеток и клеточного мусора. Кроме того, они помогают организовать иммунную реакцию, выделяя цитокины и хемокины и представляя антигены Т-клеток и В-клеток. Макрофаги также играют важную роль во многих других процессах, таких как заживление ран, атеросклероз, опухолевие и ожирение.
Чтобы быть в состоянии обнаружить не-самостоятельно молекул, таких как патогенные молекулярные модели (PAMPs) и вне места молекул, таких как повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPs), макрофаги оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRR)1. К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта2 как трансфекционный реагент3 и трансинфицированных нуклеиновых кислот4,5,6,7часто признаются PRRs как не-самостоятельно. По этой причине трансфекция макрофагов с использованием химических или физических методов8 обычно приводит к активации макрофагов и деградации транс-инфицированных нуклеиных кислот или даже в самоубийстве макрофагов с помощью пироптоза, формы запрограммированной гибели литикических клеток, вызванной после распознавания цитосолильных PAMPs/DAMPs, таких как ДНК или чужая РНК9. Биологическая трансфекция макрофагов с использованием вирусов, таких как аденовирусы или лентивирусы в качестве переносчиков часто более эффективна, но строительство таких вирусных векторов занимает много времени и требует биобезопасности уровня 2 оборудования10,11.
Таким образом, хотя макрофаги являются предметом интенсивных исследований, анализ их функций на молекулярном уровне затруднен, поскольку один из важнейших инструментов молекулярной биологии, трансфекция нуклеиновой кислоты строит для экзогенного выражения белки, вряд ли применимы. Это часто заставляет исследователей использовать макрофаговые клеточные линии, а не добросовестные макрофаги. Приложения для трансфекции конструкции нуклеиновой кислоты включают экспрессию мутировавших или помеченных белковых версий, переэкспрессию конкретного белка, повторное выражение белка в соответствующем фоне нокаута и экспрессию белков других видов (например. , Крем рекомбиназы или руководство РНК и Cas9 для целевого нокаута гена).
Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию (обычно трудно трансфектные) первичные макрофаги, то есть мурин перитонеальных макрофагов (PM) и макрофагов костного мозга (BMDM) с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Важно отметить, что в пробирке транскрибируется мРНК, генерируемых с помощью этого протокола содержит естественные модифицированные нуклеозиды 5-метил-CTP и псевдо-UTP, которые снижают иммуногенность и повышают стабильность4,6,7,12,13. Кроме того, 5'-концы в пробирке транскрибируется мРНК дефосфорилированы антарктической фосфатазы, чтобы предотвратить признание RIG-I комплекс14,15. Это сводит к минимуму врожденное иммунное распознавание в пробирке транскрибированной мРНК. С нашим простым в выполнении протокола, скорость трансфекции между 50-65% (перитонеальные макрофаги (PM)) и 85% (BMDM) достигаются в то время как, что важно, нет цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем (i) как иммунологически заглушенная мРНК для трансфекции может быть получена из конструкций ДНК, таких как плазмиды и (ii) сама процедура трансфекции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, специализирующимися на обнаружении молекул несобственного происхождения. С этой целью они оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRRs). К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта, как трансфекционный реагент и транс-инфицированных нуклеиевых кислот часто признаются PRRs как не-самостоятельно. Поэтому трансфекция часто приводит к активации макрофагов и деградации трансинфицированных нуклеиновых кислот или даже к самоубийству макрофагов. Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию основных макрофагов, таких как перитонеальные макрофаги (ТЧ) и макрофаги костного мозга (BMDM) с мРНК в пробирке, транскрибированной из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. С помощью этого простого протокола, трансфекционная скорость около 50-65% для ТЧ и около 85% для BMDM достигаются без цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем генерацию мРНК для трансфекции из конструкций ДНК, таких как плазмиды и процедура трансфекции.

Мы успешно использовали этот протокол для создания кодирования мРНК для вариантов NEMO и IKK, отмеченных FLAG, для трансфекции первичных макрофагов16. Плазмиды, кодирующие для FLAG-tagged дикого типа (NEMOWT)и C54/347A мутант NEMO (NEMOC54/374A) (см. Таблица материало...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Макрофаги, особенно первичные макрофаги, являются сложными для трансфекта, поскольку они специализируются на обнаружении молекул несобственного происхождения. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды.

Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

электронный звон Потому что макрофаги специализируются на обнаружении молекул не-саморождения, они особенно трудно трансфект. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с помощью мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Основным преимуществом нашего метода является то, что высокие показатели трансинфекции достигаются при отсутствии какой-либо обнаруживаемой цитотоксичности или иммуногенности.Демонстрация процедуры будет Марк Херб postdoc из моей лаборатории. Начните с оттаивания всех компонентов комплекта транскрипции РНК. Вихрь реагентов в течение пяти секунд и спина их вниз в течение двух секунд на 2000 раз г, а затем держать их на льду до использования.Подготовь реакцию транскрипции РНК в микроцентрифуге в 0,5-микролитерной трубке в соответствии с рукописными указаниями. Вихрь трубки и спина его вниз. Затем инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут при смешивании при 400 об/мин на тепловом миксере.После инкубации добавьте два микролитров DNase I непосредственно в смесь реакции. Вихрь и спина трубки вниз, и инкубировать его в тепловой смеситель еще 15 минут. Зарезервировать двухмиберный алицит продукта, обработанного Dnase, для контрольного геля и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Для хвостохранилища полиА добавьте пять микролитров буфера реакции полимеразы 10X polyA и пять микролитров полимеразы полиА в реакцию, обработанную Dnase. Vortex и спина вниз смесь. Затем инкубировать его в термальный миксер в течение 30 минут.Когда реакция будет завершена, возьмите алицит с двумя микролитровами для контрольного геля и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 5-премьер-реагенты дефофорилирования непосредственно к хвостохранилищу полиА в соответствии с рукописными указаниями. Вихрь и спина вниз трубки, и инкубировать его в тепловой смеситель еще 30 минут.Следуйте реакции дефосфорилирования с двухминутной инкубацией при температуре 80 градусов по Цельсию, чтобы нагреть инактивацию антарктической фосфатазы. Затем очистите транскрибированную мРНК в пробирке с помощью специального комплекта для очистки РНК. Измерьте концентрацию и чистоту элевированной мРНК с помощью микротомного спектрофотометра.Вы запустите денатурированный гель агарозы с ранее собранными алицитами, чтобы проверить наличие одного продукта, правильную длину транскрипта и полиа хвостохранилище. Приготовьтесь к трансфекции, добавив предварительно рассчитанный объем буфера трансфекции мРНК за вычетом объемов трансфектного реагента мРНК и мРНК в реакционной трубке. Оттепель мРНК бульон и смешать его осторожно, листая трубку.Затем добавьте предварительно рассчитанный объем мРНК в реакционной трубке. Vortex и спина вниз реакции смеси и мРНК трансфекции реагент, а затем добавить соответствующий объем мРНК трансфекции реагент реакции смеси трубки. Вихрь трубки и спина его вниз.Затем инкубировать его при комнатной температуре в течение 15 минут. Тем временем замените культурную среду макрофагов свежей теплой культурной средой. После того, как инкубация трансфекции смесь завершена, добавить смесь пластины скважин, содержащих макрофаги dropwise и по кругу снаружи до середины колодца.Для обеспечения равномерного распределения трансфекции смесь аккуратно раскачивает пластину в вертикальном и горизонтальном направлении. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа, по крайней мере шесть часов. После инкубации проанализируйте эффективность трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии, цитометрии потока или иммуноблот.Наиболее важной частью этой процедуры является обеспечение равномерного распределения трансфектной смеси таким образом, чтобы все макрофаги соедеяли с одинаковым количеством мРНК. Этот протокол был успешно использован для генерации вариантов NEMO и IKK-бета с метками FLAG для трансфекции первичных макрофагов. Правильный размер и полиА хвостохранилище мРНК было проверено электрофорезом агарозного геля.Эффективность трансфекции была подтверждена путем генерации мРНК, кодирующей GFP, и проведения анализа цитометрии потока. Скорость трансфекции увеличилась вместе с количеством трансфицированных мРНК, достигнув 50-65% для ТЧ и от 80 до 85% для BMDM. Как в ТЧ, так и в БМДМ уровень экспрессии ЭГПП в трансфицированных клетках увеличивался во времени и в зависимости от дозы.Важно отметить, что анализ пропидия йодида-положительного или приложение V-положительных макрофагов подтвердил, что процедура трансфекции не вызывает литик или апоптотической смерти клеток. Эффективность трансфекции мРНК, кодирующих варианты Nemo или IKK-beta с тегами FLAG, были проанализированы с помощью иммунофлюоресценции микроскопии. Тарифы составили около 60% для Nemo mRNAs и 55% для IKK-бета mRNAs.Этот протокол также использовался для генерации мРНК-кодирования рекомбиназы Cre. Трансфекция 400 000 BMDM с 400 нанограммами Cre recombinase mRNA привела к почти полному истощению белка Немо через 48 часов, что свидетельствует о высокоэффективной трансфекции. Отсутствие каких-либо обнаруживаемых количеств бета Interleukin 1, Интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли указывает на то, что процедура трансфекции не активирует провоспалительные сигналы.Наш относительно простой метод, наконец, позволяет эффективно выражать мутировавшие или помеченные белки в первичных макрофагах. Это существенно еще больше еще больше далее анализ функций макрофагов на молекулярном уровне.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Количественное Цитозольные против вакуолярной<em&gt; Сальмонелла</em&gt; В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Фагосоме Миграция и скорость, измеренная в живых первичных макрофагах человека, инфицированных ВИЧ-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...