Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

El aislamiento de macrófagos de ratones se realizó de conformidad con la Ley de Protección Animal de Alemania en cumplimiento con el Comité de ética de la Universidad de Colonia.
NOTA: Lleve a cabo todos los pasos con guantes. Llevar a cabo todos los pasos de transfección bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las células. Antes de trabajar con ARNm, limpie todos los instrumentos, como pipetas y todas las superficies con un 70% de etanol y/o ...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Aquí presentamos un protocolo para la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios generalmente difíciles de transfectar con ARNm transcrito in vitro. Es importante destacar que la transfección de los macrófagos utilizando este protocolo no induce la muerte celular ni activa la señalización proinflamatoria, lo que indica que ni el reactivo de transfección ni el ARNm transfectóse se reconocen como no autónomos.
La calidad del ARNm es de vital importancia para el éxito de...

Los macrófagos son células fagocíticas que se especializan en la detección, ingesta y degradación de microbios, células apoptóticas y desechos celulares. Además, ayudan a orquestar las respuestas inmunitarias secretando citoquinas y quimioquinas y presentando antígenos a las células T y células B. Los macrófagos también desempeñan un papel importante en numerosos otros procesos, como la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, la tumorigenesis y la obesidad.
Para poder detectar moléculas no propias, como los patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) y las moléculas fuera de lugar, como los patrones moleculares asociados al daño (DAPP), los macrófagos están equipados con una amplia gama de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)1. Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar2 como el reactivo de transfección3 y los ácidos nucleicos transinfectados4,5,6,7 a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por esta razón, la transfección de macrófagos utilizando métodos químicos o físicos8 suele dar lugar a la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transcijos o incluso en el suicidio de macrófagos a través de la piroptosis, una forma de muerte celular lítica programada desencadenada después del reconocimiento de Los PamP/DMIP citosólicos, como el ADN o el ARN extraño9. La transfección biológica de macrófagos utilizando virus como adenovirus o lentivirus como vectores es a menudo más eficiente, sin embargo, la construcción de estos vectores virales es lenta y requiere equipos de nivel 2 de bioseguridad10,11.
Así, aunque los macrófagos son objeto de una intensa investigación, el análisis de sus funciones a nivel molecular se ve obstaculizado porque una de las herramientas más importantes de la biología molecular, la transfección de construcciones de ácido nucleico para la expresión exógena de proteínas, no es aplicable. Esto a menudo obliga a los investigadores a utilizar líneas celulares similares a macrófagos en lugar de macrófagos de buena fe. Las aplicaciones para la transfección de construcción de ácido nucleico incluyen la expresión de versiones de proteínas mutadas o etiquetadas, la sobreexpresión de una proteína específica, la reexpresión de proteínas en un fondo de eliminatoria respectivo y la expresión de proteínas de otras especies (por ejemplo. , Cre recombinase o ARN guía y Cas9 para el knockout genético dirigido).
Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios (generalmente difíciles de transfectar), es decir, macrófagos peritoneales murinos (PM) y macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) con ARNm generado a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Es importante destacar que el ARNm transcrito in vitro generado con este protocolo contiene los nucleósidos modificados de origen natural 5-metil-CTP y pseudo-UTP que reducen la inmunogenicidad y mejoran la estabilidad4,6,7,12,13. Además, los 5'-extremos del ARNm transcrito in vitro son desfosforilados por la fosfatasa antártica para evitar el reconocimiento por el complejo RIG-I14,15. Esto minimiza el reconocimiento inmune innato del ARNm transcrito in vitro. Con nuestro protocolo fácil de realizar, se alcanzan tasas de transfección entre 50-65% (macrófagos peritoneales (PM)) y 85% (BMDM) mientras que, lo que es importante, no se observacitotoxicidad ni inmunogenicidad. Describimos en detalle (i) cómo el ARNm silenciado inmunológicamente para la transfección se puede generar a partir de construcciones de ADN como plásmidos y (ii) el propio procedimiento de transfección.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Los macrófagos son células fagocíticas especializadas en la detección de moléculas de origen no propio. Con este fin, están equipados con una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar, ya que el reactivo de transfección y los ácidos nucleicos transinfectados a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por lo tanto, la transfección a menudo resulta en la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transinfectados o incluso en el suicidio de los macrófagos. Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios murinos como macrófagos peritoneales (PM) y macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con ARNm en vitro transcrito a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Con este sencillo protocolo, se alcanzan tasas de transfección de aproximadamente 50-65% para PM y de aproximadamente 85% para BMDM sin citotoxicidad ni inmunogenicidad observada. Describimos en detalle la generación de ARNm para la transfección a partir de construcciones de ADN como plásmidos y el procedimiento de transfección.

Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar codificación mRNA para las variantes ETIQUETADAs por FLAG NEMO e IKK para la transfección de macrófagos primarios16. La codificación de plásmidos para el tipo salvaje con etiqueta FLAG (NEMOWT) y C54/347A mutante NEMO (NEMOC54/374A) (véase la Tabla de Materiales) ya contienen un promotor T7 en la orientación correcta(Figura 1A</...

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Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

electrónicaMente porque los macrófagos se especializan en detectar moléculas de origen no propio, son particularmente difíciles de transfeccionar. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos. La principal ventaja de nuestro método es que se alcanzan altas tasas de transfección en ausencia de cualquier citotoxicidad o inmunogenicidad detectable.Demostrando el procedimiento estará Marc Herb un postdoctorado de mi laboratorio. Comience descongelando todos los componentes del kit de transcripción de ARN. Vórtice los reactivos durante cinco segundos y gire hacia abajo durante dos segundos a 2.000 veces g, luego manténgalos sobre hielo hasta su uso.Preparar la reacción de transcripción de ARN in vitro en un tubo de microcentrífuga de 0,5 microlitros de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Haz un vórtice en el tubo y gírla hacia abajo. Luego incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos mientras se mezcla a 400 rpm en un mezclador térmico.Después de la incubación, añadir dos microlitros de DNase I directamente en la mezcla de reacción. Vórtice y gire el tubo hacia abajo, e incubarlo en la mezcladora térmica durante otros 15 minutos. Reserve una alícuota de dos microlitrotros del producto tratado con Dnase para el gel de control y guárdelo a menos 80 grados centígrados.Para el cola polyA, agregue cinco microlitros de tampón de reacción de poliasa poliasa 10X y cinco microlitros de polialasa polialasa a la reacción tratada con Adn. Vórtice y gire hacia abajo la mezcla. A continuación, incubarlo en la mezcladora térmica durante 30 minutos.Una vez completada la reacción, tome una alícuota de dos microlitrotro para el gel de control y guárdela a menos 80 grados centígrados. Añadir reactivos de desfosforilación de 5 primos directamente al producto de cola polyA de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Vórtice y gire hacia abajo el tubo, e incubarlo en la mezcladora térmica durante otros 30 minutos.Siga la reacción de defosforilación con una incubación de dos minutos a 80 grados celsius para calentar la fosfatasa antártica. A continuación, purifique el ARNm transcrito in vitro utilizando un kit de purificación de ARN dedicado. Mida la concentración y pureza del ARNm eluido con un espectrofotómetro de microvolumen.Ejecute un gel de agarosa desnaturalizado con las alícuotas previamente recogidas para verificar la presencia de un solo producto, la longitud correcta de la transcripción y el relación de poliA. Prepárese para la transfección añadiendo el volumen precalculado del tampón de transfección de ARNm menos los volúmenes de reactivo de transfección de ARNm y el ARNm a un tubo de reacción. Descongele el caldo de ARNm y mezcle suavemente volteando el tubo.A continuación, añada el volumen precalculado de ARNm al tubo de reacción. Vórtice y gire hacia abajo la mezcla de reacción y el reactivo de transfección de ARNm, luego agregue el volumen adecuado del reactivo de transfección de ARNm al tubo de mezcla de reacción. Haz un vórtice en el tubo y gírla hacia abajo.Luego incubarlo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto, reemplace el medio de cultivo de los macrófagos por un medio de cultivo fresco y cálido. Una vez completada la incubación de la mezcla de transfección, añadir la mezcla a los pocillos de placa que contienen los macrófagos por gota y en un círculo desde el exterior hasta el centro del pozo.Para asegurar una distribución uniforme de la transfección, mezcle suavemente la placa en una dirección vertical y horizontal. Luego incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante al menos seis horas. Después de la incubación, analice la eficiencia de la transfección con microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o inmunoblot.La parte más importante de este procedimiento es asegurar una distribución uniforme de la mezcla de transfección para que todos los macrófagos entren en contacto con la misma cantidad de ARNm. Este protocolo se utilizó con éxito para generar variantes NEMO e IKK-beta con etiquetas de ARNm con etiquetas DE ARNm para la transfección de macrófagos primarios. El tamaño correcto y el seguimiento de poliA del ARNm se verificaron mediante electroforesis de gel de agarosa.La eficiencia de la transfección se confirmó generando la codificación de ARNm GFP y realizando análisis de citometría de flujo. La tasa de transfección aumentó junto con la cantidad de ARNm trans infectado, llegando a 50 a 65% para PM y 80 a 85% para BMDM. Tanto en PM como en BMDM, el nivel de expresión de EGFP en las células trans infectadas aumentó en un tiempo y dependiente de la dosis.Es importante destacar que el análisis de los macrófagos propidium yoduro positivos o Annexin V positivo confirmó que el procedimiento de transfección no indujo la muerte celular lítica o apoptótica. La eficiencia de la transfección de los mRNAs que codifican las variantes Nemo o IKK-beta con flagrante se analizó con microscopía de inmunofluorescencia. Las tasas fueron de alrededor del 60% para nemo mRNAs y del 55% para los MRNAs IKK-beta.Este protocolo también se utilizó para generar la codificación de ARNm Cre recombinase. La transfección de 400.000 DDM con 400 nanogramos de ARNm recombinasa de Cre dio lugar a un agotamiento casi completo de la proteína Nemo después de 48 horas, lo que indica una transfección altamente eficiente. La ausencia de cantidades detectables de Interleucina 1 beta, Interleucina-6 y factor de necrosis tumoral indica que el procedimiento de transfección no activa la señalización proinflamatoria.Nuestro método relativamente simple finalmente permite expresar eficientemente proteínas mutadas o etiquetadas en macrófagos primarios. Esto aumentaría sustancialmente el análisis de las funciones de los macrófagos a nivel molecular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Investigación

Inmunología e Infección

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Cuantificación de Citosólica vs. Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; En macrófagos primarios por permeabilización diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...