Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Makrofagisolering från möss utfördes i enlighet med lagen om djurskydd i Tyskland i överensstämmelse med etikkommittén vid Kölns universitet.
Anmärkning: Utför alla steg som bär handskar. Utför alla transfektion steg under en laminär Flow Hood för att förhindra kontaminering av cellerna. Innan du arbetar med mRNA ska du rengöra alla instrument som pipetter och varje yta med 70% etanol och/eller ett RNAse-nedbrytande ytaktivt ämne (tabell över material<...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages.">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li><li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Här presenterar vi ett protokoll för mycket effektiv transfektion av vanligtvis svåra att transfect primära makrofager med in vitro transkriberas mRNA. Viktigt är att transfektion av makrofager som använder detta protokoll inte inducerar celldöd eller aktiverar proinflammatorisk signalering som indikerar att varken transfektion reagens eller transfekterade mRNA erkänns som icke-Self.
Kvaliteten på mRNA är av avgörande betydelse för framgångsrik transfektion av makrofager med hjäl...

Makrofager är fagocyterande celler som specialiserat sig på att upptäcka, intag och förnedrande mikrober, apoptotiska celler och cellulära skräp. Dessutom, de hjälper till att iscengöra immunsvar genom att utsönta cytokiner och chemokiner och genom att presentera antigener till T-celler och B-celler. Macrophages spelar också viktiga roller i många andra processer, såsom sårläkning, åderförkalkning, tumorigenes och fetma.
För att kunna detektera icke-själv-molekyler som patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) och out-of-Place molekyler såsom skadeassocierade molekylära mönster (DAMPs), makrofager är utrustade med ett stort utbud av mönsterigenkänning receptorer (PRR)1. Tyvärr gör detta också makrofager särskilt utmanande att transfect2 som transfektion reagens3 och transfekterade nukleinsyror4,5,6,7 ofta erkänns av PRRS som icke-jaget. Av denna anledning, transfektion av makrofager med kemiska eller fysikaliska metoder8 vanligtvis resulterar i makrofagaktivering och nedbrytning av transfekterade nukleinsyror eller ens i makrofagsjälvmord via pyroptos, en form av programmerad lytisk celldöd utlöst efter erkännande av cytosoliska PAMPs/damps såsom DNA eller främmande RNA9. Biologisk transfektion av makrofager med virus som adenovirus eller lentivirus som vektorer är ofta mer effektiv, men byggandet av sådana virusvektorer är tidskrävande och kräver biosäkerhet nivå 2 utrustning10,11.
Även om makrofager är föremål för intensiv forskning hämmas därför analys av deras funktioner på molekylär nivå eftersom ett av de viktigaste verktygen för molekylärbiologi, transfektion av nukleinsyra konstruktioner för EXOGEN uttryck av proteiner, är knappast tillämplig. Detta tvingar ofta forskare att använda makrofagliknande cellinjer i stället för bona fide makrofager. Tillämpningar för nukleinsyra konstruera transfektion inkludera uttryck av muterade eller märkta protein versioner, överuttryck av ett specifikt protein, protein nytt uttryck i en respektive knockout bakgrund och uttryck av proteiner från andra arter (t. ex. , CRE driver eller guide RNA och Cas9 för riktad genknockout).
Här, vi beskriver ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av (vanligtvis svårt att transfect) primära makrofager, som är murina peritonealdialys makrofager (PM) och benmärg-derived makrofager (BMDM) med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider. Viktigt, den in vitro-transkriberas mRNA genereras med hjälp av detta protokoll innehåller naturligt förekommande modifierade nukleosider 5-metyl-CTP och pseudo-UTP som minskar immunogenicitet och förbättra stabiliteten4,6,7,12,13. Dessutom är 5 '-ändarna av in vitro transkriberas mRNA defosforyleras av antarktisk fosfatas för att förhindra erkännande av Rig-i Complex14,15. Detta minimerar medfödda immun erkännande av in vitro transkriberas mRNA. Med vår lätt att utföra protokoll, transfektion priser mellan 50-65% (peritoneal makrofager (PM)) och 85% (BMDM) uppnås medan, viktigare, det finns ingen cytotoxicitet eller immunogenicitet observerats. Vi beskriver i detalj (i) hur immunologiskt tystade mRNA för transfektion kan genereras från DNA-konstruktioner som plasmider och (II) själva transfektioningreppet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Makrofager är fagocyterande celler specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung. För detta ändamål är de utrustade med ett stort utbud av mönster igenkännings receptorer (PRRs). Tyvärr gör detta också makrofager särskilt utmanande att transfect som transfektion reagens och transfekterade nukleinsyror ofta erkänns av PRRS som icke-jaget. Därför, transfektion resulterar ofta i makrofagaktivering och nedbrytning av transfekterade nukleinsyror eller ens i självmord av makrofager. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av murin primära makrofager såsom peritonealdialys makrofager (PM) och benmärg-derived makrofager (BMDM) med mRNA in vitro transkriberas från DNA-mallar såsom plasmider. Med detta enkla protokoll, transfektionshastigheter på cirka 50-65% för PM och om 85% för BMDM uppnås utan cytotoxicitet eller immunogenicitet observerats. Vi beskriver i detalj generering av mRNA för transfektion från DNA konstruktioner såsom plasmider och transfektion förfarande.

Vi har framgångsrikt använt detta protokoll för att generera mRNA-kodning för flagga-taggade NEMO och IKKβ varianter för transfektion av primära makrofager16. Plasmiderna kodning för flagga-taggade Wild-Type (NEMOWT) och C54/347a Mutant NEMO (NemoC54/374a) (se tabellen av material) innehåller redan en T7 promotor i rätt riktning (figur 1a). Således var vi bara tvungna a...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Makrofager, särskilt primära makrofager, är utmanande att transfect som de är specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung. Vi beskriver ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av primära makrofager med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider.

Högeffektiv transfektion av primära makrofager med in vitro-transkriberad mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

elektronisk chiming Eftersom makrofager är specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung, de är särskilt svåra att transfekt. Vi beskriver ett protokoll som tillåter högeffektiva transfection av primära makrofager med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider. Den största fördelen med vår metod är att höga transfektionsfrekvenser uppnås i avsaknad av någon påvisbar cytotoxicitet eller immunogenicitet.Demonstrera förfarandet kommer att Marc Herb en postdoc från mitt laboratorium. Börja med att tina upp alla komponenter i RNA-transkriptionssatsen. Vortexa reagenserna i fem sekunder och snurra ner dem i två sekunder vid 2, 000 gånger g, sedan hålla dem på is tills användning.Förbered in vitro RNA transkriptionsreaktionen i en 0,5-mikroliter mikrocentrifug röret enligt manuskriptet riktningar. Vortexa röret och snurra ner det. Sedan inkubera den på 37 grader Celsius i 30 minuter medan du blandar på 400 rpm på en termisk mixer.Efter inkubationen, tillsätt två mikroliter av DNase jag direkt i reaktionsmixen. Vortexa och snurra röret ner, och inkubera den i termisk mixer i ytterligare 15 minuter. Reservera en två-mikroliter alikvot av dnasbehandlade produkten för kontrollgelen och förvara den på minus 80 grader Celsius.För polyA tailing, tillsätt fem mikroliter av 10X polyA polymeraskedad reaktion buffert och fem mikroliter av polyA polymeras till dnasbehandlade reaktionen. Vortexa och snurra ner mixen. Sedan inkubera den i termisk mixer i 30 minuter.När reaktionen är klar, ta en två-microliter alikvot för kontrollgelen och förvara den på minus 80 grader Celsius. Tillsätt 5-prime defosforyleringsreagenser direkt till polyA tailed produkten enligt manuskriptet riktningar. Vortexa och snurra ner röret, och inkubera det i termisk mixer i ytterligare 30 minuter.Följ avfosforyleringsreaktionen med en två minuters inkubation vid 80 grader Celsius för att värma inaktivering av antarktisk fosfatas. Sedan rena in vitro transkriberas mRNA med hjälp av en dedikerad RNA reningssats. Mät koncentrationen och renheten hos det eluterade mRNA med en mikrovolymspektrofotometer.Kör en denatureringsagargin med de tidigare insamlade alikvoterna för att verifiera förekomsten av en enda produkt, korrekt transkriptionslängd och polyA-anrikning. Förbered för transfektion genom att lägga till den förberäknade volymen av mRNA-transfection buffert minus volymerna av mRNA-transfection-reagens och mRNA till ett reaktionsrör. Tina mRNA-stocken och blanda det försiktigt genom att vända röret.Lägg sedan till den förberäknade volymen av mRNA till reaktionsröret. Vortexa och snurra ner reaktionsmixen och mRNA-transfektionsreagensen, tillsätt sedan lämplig volym av mRNA-reagensen för transfection till reaktionsblandningsröret. Vortexa röret och snurra ner det.Sedan inkubera den i rumstemperatur i 15 minuter. Under tiden, ersätta odlingsmediet av makrofager med färskt varmt odlingsmedium. När inkuberingen av transfektionsblandningen är klar, tillsätt blandningen till plattan brunnar som innehåller makrofager droppvis och i en cirkel från utsidan till mitten av brunnen.För att säkerställa en jämn fördelning av transfection mix försiktigt gunga plattan i en vertikal och horisontell riktning. Sedan inkubera plattan på 37 grader Celsius och 5% koldioxid i minst sex timmar. Efter inkubationen, analysera transfektionseffektivitet med fluorescensmikroskopi, flödescytometri eller immunoblot.Den viktigaste delen av detta förfarande är att säkerställa en jämn fördelning av transfektionsmixen så att alla makrofager kommer i kontakt med samma mängd mRNA. Detta protokoll användes framgångsrikt för att generera mRNA-kodning FLAG-taggade NEMO och IKK-beta varianter för transfektion av primära makrofager. Korrekt storlek och polyA tailing av mRNA verifierades genom agarosgelelektrofores.Transfection effektivitet bekräftades genom att generera mRNA kodning GFP och utför flöde cytometry analys. Transfektionshastighet ökade tillsammans med mängden transfekterat mRNA och nådde 50 till 65%för PM och 80 till 85%för BMDM. I både PM och BMDM ökade uttrycksnivån av EGFP i transfekterade celler på ett tids- och dosberoende sätt.Viktigt, analys av propidium iodide-positiva eller Annexin V-positiva makrofager bekräftade att transfection förfarandet inte inducera lytic eller apoptotiska celldöd. Transfection effektivitet mRNAs kodning FLAG-taggade Nemo eller IKK-beta varianter analyserades med immunofluorescens mikroskopi. Skattesatserna var cirka 60%för Nemo mRNAs och 55%för IKK-beta mRNAs.Detta protokoll användes också för att generera mRNA-kodning Cre recombinase. Transfection av 400, 000 BMDM med 400 nanogram av Cre rekombinas mRNA resulterade i nästan fullständig utarmning av Nemo protein efter 48 timmar, vilket indikerar mycket effektiv transfection. Frånvaron av några detekterbara mängder interleukin 1 beta, Interleukin-6 och tumörnekrosfaktor indikerar att transfektionsproceduren inte aktiverar proinflammatorisk signalering.Vår relativt enkla metod slutligen gör det möjligt att effektivt uttrycka muterade eller taggade proteiner i primära makrofager. Detta skulle väsentligen främja analysen av macrophage fungerar på det molekylärt jämnar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

En enkel och effektiv metod att isolera Makrofager från Blandad Primär Cultures of Adult leverceller

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Inrättande av en<em&gt; In vitro</em&gt; System för att studera intracellulära Beteende<em&gt; Candida glabrata</em&gt; I Human THP-1 makrofager

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Mycket effektiv Transfektion av mänskliga THP-1 makrofager från Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Kvantifiering av cytosoliska vs. vakuolär<em&gt; Salmonella</em&gt; I primära makrofager genom Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Phagosome Migration och Velocity Mätt i Live primära humana makrofager infekterade med HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Små RNA transfektion i primära humana Th17 celler genom Next Generation elektroporering

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...