Name: highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna
Uploaded: 2019-11-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) tarafından desteklenmiştir.

Farelerden makrofaj izolasyonu, Almanya Hayvan Koruma Kanunu'na uygun olarak Köln Üniversitesi Etik Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Eldiven giyerek tüm adımları atın. Hücrelerin kontaminasyonunu önlemek için laminar akış başlığı altında tüm transfeksiyon adımlarını uygulayın. mRNA ile çalışmadan önce, pipetler ve her yüzey gibi tüm aletleri %70 etanol ve/veya RNAe bozucu yüzey aktif madde(Malzeme Tablosu)ile t...

<ol>
	<li>Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Mouse+Macrophages+Sense+What+Is+Going+On.">How Mouse Macrophages Sense What Is Going On.</a> Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).</li><li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages:+obstacles+and+opportunities.">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+reagent+Lipofectamine+triggers+type+I+interferon+signaling+activation+in+macrophages.">Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages.</a> Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).</li><li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA:+implication+for+therapeutic+RNA+development.">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).</li><li>Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+but+not+plasmid+DNA+is+efficiently+transfected+in+murine+J774A.1+macrophages.">mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages.</a> Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).</li><li>Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+mRNA+Chemical+Modification+to+Maximize+Protein+Expression+with+Reduced+Immunogenicity.">Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity.</a> Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Khantakova, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+bone+marrow+derived+cells+with+immunoregulatory+proteins.">Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins.</a> Cytokine. 108, 82-88 (2018).</li><li>Franz, K. M., Kagan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Receptors+as+Competitive+Determinants+of+Cell+Fate.">Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate.</a> Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorganic &amp; medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice.">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).</li><li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors:+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA.">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li><li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I.">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.</a> Science. 314 (5801), 994-997 (2006).</li><li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5'-phosphates.">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.</a> Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).</li><li>Herb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+enable+proinflammatory+signaling+through+disulfide+linkage+of+NEMO.">Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO.</a> Science Signaling. 12 (568), (2019).</li><li>Schmidt-Supprian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEMO/IKK+gamma-deficient+mice+model+incontinentia+pigmenti.">NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti.</a> Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).</li><li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA.">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li><li>Oh, S., Kessler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+Assembly,+Production,+and+Transfection+of+Synthetic+Modified+mRNA.">Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA.</a> Methods. 133, 29-43 (2018).</li></ol>

Burada in vitro transkripsiyonu mRNA ile genellikle transfect primer makrofajların yüksek verimli transfeksiyonu için bir protokol salıyoruz. Daha da önemlisi, bu protokolü kullanarak makrofajların transfeksiyonu hücre ölümüne neden olmaz veya proinflamatuar sinyali aktive etmez ve transfeksiyon reaktifinin veya transfected mRNA'nın kendi kendine tanınmadığını gösterir.
Bu protokolü kullanarak makrofajların başarılı bir şekilde transfeksiyonu için mRNA'nın kalitesi ç...

Makrofajlar, mikropları, apoptotik hücreleri ve hücresel enkazı tespit etme, sindiren ve alçaltma konusunda uzmanlaşmış fagositik hücrelerdir. Ayrıca, sitokinler ve kemokinler salgılayarak ve T hücreleri ve B hücrelerine antijenler sunarak bağışıklık yanıtları düzenlemek için yardımcı olur. Makrofajlar aynı zamanda yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümörigenez ve obezite gibi birçok diğer süreçlerde de önemli rol oynarlar.
Patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP' ler) ve hasarla ilişkili moleküler desenler (DAMP' ler) gibi yersiz molekülleri tespit edebilmek için makrofajlar geniş bir dizi örüntü tanıma reseptörü (PRR)1ile donatılmıştır. Ne yazık ki, bu da transfeksiyon reaktifi olarak transfect2 özellikle zor makrofajlar yaparve transfected nükleik asitler4,5,6,7 genellikle non-self olarak PrRs tarafından kabul edilmektedir. Bu nedenle, makrofajların kimyasal veya fiziksel yöntemlerle transfeksiyonugenellikle makrofaj aktivasyonu ve transfekte nükleik asitlerin bozulması ve hatta piroptoz yoluyla makrofaj intiharı ile sonuçlanır, dna veya yabancı RNA9gibi sitosolik PAMP'lerin/DAMP'ların tanınmasından sonra tetiklenen programlanmış litik hücre ölümü formu. Vektörler gibi adenovirüs veya lentiviruses gibi virüsler kullanarak makrofajlar biyolojik transfeksiyon genellikle daha verimli, henüz bu tür viral vektörlerin inşaat zaman alıcı ve biyogüvenlik seviyesi 2 ekipmangerektirir 10,11.
Bu nedenle, makrofajlar yoğun araştırma konusu olmasına rağmen, moleküler düzeyde işlevlerinin analizi engellenir çünkü moleküler biyolojinin en önemli araçlarından biri olan nükleik asit infeksiyonu eksojen ifade için proteinler, pek uygulanabilir. Bu genellikle araştırmacıları iyi niyetli makrofajlar yerine makrofaj benzeri hücre hatlarını kullanmaya zorlar. Nükleik asit yapı transfeksiyonu için uygulamalar mutasyona uğramış veya etiketlenmiş protein versiyonlarının ekspresyonu, belirli bir proteinin aşırı ekspresyonu, ilgili nakavt arka planında proteinin yeniden ekspresyonu ve diğer türlerden proteinlerin ekspresyonu (örn. , Cre rekombinaz veya hedeflenen gen nakavt için RNA ve Cas9 kılavuzu).
Burada, plazmidler gibi DNA şablonlarından üretilen mRNA ile mRNA ile mrna peritoneal makrofajlar (PM) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi birincil makrofajların (genellikle transfect zor) yüksek verimli transfeksiyon sağlayan bir protokol açıklar. Daha da önemlisi, bu protokol kullanılarak oluşturulan in vitro transkripsiyonlu mRNA, immünjeniteyi azaltan ve stabiliteyi artıran 5-metil-CTP ve psödo-UTP içeren doğal olarak modifiye edilmiş nükleozitler içerir4,6,7,12,13. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu mRNA 5 '-uçları RIG-I kompleksi14,15tarafından tanınmasını önlemek için Antarktika fosfataz tarafından defosforile vardır. Bu in vitro transkripsiyonlu mRNA doğuştan bağışıklık tanıma en aza indirir. Kolay icra edilen protokolümüzle transfeksiyon oranları %50-65 (periton makrofajları (PM)) ve %85 (BMDM) arasında, daha da önemlisi sitotoksisite veya immünojenite gözlenmez. Transfeksiyon için immünolojik olarak susturulan mRNA'nın plazmidler ve (ii) transfeksiyon prosedürü nün kendisi gibi DNA yapılarından nasıl üretilebileceğini ayrıntılı olarak (i) açıklarız.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-methyl-CTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1138S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic phosphatase reaction buffer (10X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0289</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NEMO/IKK&#947; antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA1-41046</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 92,16 mm with cams</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821,473</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Microbeads mouse and human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#180;-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3&#180;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Digest buffer (10X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B64</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0684</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0491S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor forward primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKK&#946; + T7-Promotor reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3&#8242;, stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2060</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER</td>
			<td>Polyplus transfection</td>
			<td>409-0001DE</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant IKK&#946; IKK-2S177/181E plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11105</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutant NEMOC54/347A plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N3 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>62043</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(I:C)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528906</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPGK-Cre plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre
recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and
an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pseudo-UTP (100 mM)</td>
			<td>Jena Biosience</td>
			<td>NU-1139S</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101212</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4801-82</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-02</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure LPS from E.coli O111:B4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td></td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type IKK&#946; plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11103</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type NEMO plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27268</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mrna

Makrofajlar, kendine özgü olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşmış fagositik hücrelerdir. Bu amaçla, onlar desen tanıma reseptörleri büyük bir dizi ile donatılmıştır (PRRs). Ne yazık ki, bu da transfection reaktif ve transfected nükleik asitler genellikle non-self olarak PrRs tarafından tanınan olarak transfect özellikle zor makrofajlar yapar. Bu nedenle transfeksiyon genellikle makrofaj aktivasyonu ve transfected nükleik asitlerin bozulması ve hatta makrofajların intiharı ile sonuçlanır. Burada, periton makrofajları (PM) ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) gibi mRNA in vitro plazmidler gibi DNA şablonlarından transkripsiyonu ile yüksek verimli transföyt sağlayan bir protokol açıklıyoruz. Bu basit protokol ile PM için yaklaşık %50-65, BmDM için ise yaklaşık %85 transfeksiyon oranları sitotoksisite veya immünojenite gözlenmeden elde edilir. Plazmidler ve transfeksiyon prosedürü gibi DNA yapılarından transfeksiyon için mRNA üretimini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Birincil makrofajların transfeksiyonu için FLAG etiketli NEMO ve IKKβ varyantları için mRNA kodlaması oluşturmak için bu protokolü başarıyla kullandık16. FLAG etiketli yabani tip (NEMOWT)ve C54/347A mutant NEMO (NEMOC54/374A) (Malzemeler Tablosunabakınız) için kodlama plazmidler zaten doğru yönde bir T7 promotor içerir(Şekil 1A). Böylece, sadece in vitro transk...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

elektronik chiming Makrofajlar kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit konusunda uzmanolduğundan, transfect özellikle zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile primer makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz. Yöntemimizin en büyük avantajı, tespit edilebilir sitotoksisite veya immünojenite yokluğunda yüksek transfeksiyon oranlarının elde edilebilmiş olmasıdır.Prosedürü gösteren Marc Herb benim laboratuvarımdan bir postdoc olacak. RNA transkripsiyon kitinin tüm bileşenlerini eriterek başlayın. Girdap reaktifler beş saniye ve 2,000 kez g iki saniye için aşağı spin, sonra kullanıma kadar buz üzerinde tutmak.El yazması yönlere göre 0,5 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüp içinde in vitro RNA transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın. Tüpü girve aşağı çevir. Daha sonra 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatarak 400 rpm'de termal mikserde karıştırın.Kuluçkadan sonra, doğrudan reaksiyon karışımıiçine DNase I iki mikrolitre ekleyin. Girdap ve tüp aşağı spin ve başka bir 15 dakika daha termal karıştırıcı içinde kuluçka. Kontrol jeli için Dnase ile işlenmiş ürünün iki mikrolitrelik bir aliquot'u rezerve edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.PolyA atıkları için, Dnase ile tedavi edilen reaksiyona beş mikrolitre 10X poliA polimeraz reaksiyon tamponu ve beş mikrolitre poliA polimeraz ekleyin. Girdap ve karışımı aşağı spin. Sonra 30 dakika boyunca termal mikserde kuluçkaya yatırın.Reaksiyon tamamlandığında, kontrol jeli için iki mikrolitrelik bir aliquot alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. 5-prime dephosphorilasyon reaktiflerini el yazması yönergelere göre doğrudan polyA kuyruklu ürüne ekleyin. Girdap ve tüp aşağı spin ve başka bir 30 dakika daha termal karıştırıcı içinde kuluçka.Antarktika fosfatazını ısıtmak için 80 santigrat derecede iki dakikalık bir kuluçka ile defosforilasyon reaksiyonunu takip edin. Daha sonra özel bir RNA arıtma kiti kullanarak in vitro transkripsiyonu mRNA arındırın. Bir mikro hacim spektrofotometre ile eluted mRNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün.Tek bir ürünün varlığını doğrulamak için daha önce toplanan aliquots ile bir denaturing agarose jel çalıştırın, doğru transkript uzunluğu, ve poliA atık. MRNA transfeksiyon arabelleği hacimleri eksi mRNA transfeksiyon reaktifi ve mRNA hacimlerini bir reaksiyon tüpüne ekleyerek transfeksiyona hazırlanın. mRNA stoğunu eritin ve tüpü çevirerek hafifçe karıştırın.Daha sonra reaksiyon tüpüne önceden hesaplanmış mRNA hacmini ekleyin. Girdap ve reaksiyon karışımı ve mRNA transfeksiyon reaktifaşağı spin, sonra reaksiyon karışımı tüp için mRNA transfeksiyon reaktif uygun hacmi ekleyin. Tüpü girve aşağı çevir.Sonra 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bu arada, taze sıcak kültür ortamı ile makrofajlar kültür ortamı değiştirin. Transfeksiyon karışımının kuluçkası tamamlandıktan sonra, karışımı makrofajları içeren plaka kuyularına ekleyin ve dışarıdan kuyunun ortasına doğru bir daire çizin.Transfeksiyon karışımının düzgün dağılımını sağlamak için plakayı dikey ve yatay yönde hafifçe sallayın. Sonra en az altı saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra transfeksiyon verimliliğini floresan mikroskop, akış sitometrisi veya immünoblot ile analiz edin.Bu işlemin en önemli kısmı transfeksiyon karışımının tek tip dağılımını sağlamaktır, böylece tüm makrofajlar aynı miktarda mRNA ile temas eder. Bu protokol, birincil makrofajların transfeksiyonu için FLAG etiketli NEMO ve IKK-beta türevlerini kodlamak için başarıyla kullanılmıştır. MRNA'nın doğru boyutu ve poliA takibi agarose jel elektroforezi ile doğrulandı.Transfeksiyon verimliliği, mRNA kodlama GFP'si üretilmesi ve akış sitometri analizi nin gerçekleştirilmesi ile doğrulandı. Transfeksiyon oranı transfected mRNA miktarı ile birlikte artarak PM için %50-65 ve BMDM için %80-85'e ulaştı. Hem PM hem de BMDM'de transfected hücrelerde EGFP ekspresyonu düzeyi zaman ve doza bağlı bir şekilde artmıştır.Daha da önemlisi, propidium iyodür-pozitif veya Annexin V-pozitif makrofajların analizi transfeksiyon prosedürünün litik veya apoptotik hücre ölümüne neden olmadığını doğrulamıştır. FLAG etiketli Nemo veya IKK-beta varyantlarını kodlayan mRNA'ların transfeksiyon etkinliği immünoforeskans mikroskobu ile analiz edildi. Bu oranlar Nemo mRNA'larda %60, IKK-beta mRNA'larda ise %55 idi.Bu protokol aynı zamanda mRNA kodlama Cre recombinaz oluşturmak için kullanılmıştır. 400, 000 BMDM'nin 400 nanogram Cre rekombinaz mRNA ile transfeksiyonu, 48 saat sonra Nemo proteininin neredeyse tamamen tükenmesiyle sonuçlandı ve bu da yüksek verimli transfeksiyonu gösteriyordu. İnleökin 1 beta, Interlökin-6 ve tümör nekroz faktöründe saptanabilir miktarda olmaması transfeksiyon prosedürünün pro-inflamatuar sinyali aktive etmediğini göstermektedir.Bizim nispeten basit yöntem nihayet verimli birincil makrofajlar mutasyona uğramış veya etiketli proteinlerin ifade sağlar. Bu, moleküler düzeyde makrofaj fonksiyonlarının analizini önemli ölçüde daha da ileriye taşıyacağıgibi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...