Name: a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) for teknisk support, Joana Gomes og Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) for at opretholde Anopheles myg kolonier. Finansieret af Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Mus blev fremstillet fra IHMT dyrehus. Dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med den portugisiske lovgivning og retningslinjer for anvendelse af forsøgsdyr. Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal godkendte alle undersøgelsesprotokollerne (id-godkendelser: 023351 og 023355).
BEMÆRK: Udfør alle fodringsanalyser ved ~26 °C.
1. Myg
<ol><li>Vedligehold Anopheles coluzzii (tidligere Anopheles gambiae M form) Yaoundé stamme myg ved 26 °C, 75% fugtighed under en 12 h:12 h lys: mørk cyklus. House myg ved hjælp af standard insekttiske forhold for at garantere parring.</li>
	<li>Saml myggeder i en lille vandbeholder. Placer beholderen inde i en myg bur for at lade voksne myg dukke op og parre. Giv 10% glukose fodring løsning. Tre dage efter fremkomsten indsamle det nødvendige antal myg fra bestanden bur ved hjælp af en aspirator.</li>
	<li>En dag før fodring forsøg, fjerne 10% glukose fodring løsning. BEMÆRK: 3 dage gamle myg blev brugt i hele forsøgene.</li>
</ol>2. Fodring af myg
<ol><li>Forberedelse af kunstig flydende kost<ol>
<li>Forbered den kunstige flydende kost under sterile forhold i et laminar flow kabinet. Forbered den rige flydende kost (r-liq_diet) ved at tilføje følgende til den oprindelige flydende kost (i-liq_diet; Dulbecco's modificerede Eagle's medium [høj glukose med L-glutamin], se tabel 1): 0,55 g / L ATP, 1 g / L kolesterol, og 200 g / L kvæg serum albumin (BSA). Bland alle ingredienser grundigt og filter ved hjælp af en 0,45 μm mikrofilter. BEMÆRK: Opbevar ikke kosten; tilberede kost frisk fra bestanden løsninger for hvert eksperiment, som de mister kvalitet, når de opbevares. Kostens komponenter er beskrevet i tabel 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blodtapning af mus<ol>
<li>Bedøve 6−8 uger gamle CD1-hunmus(Mus musculus)med ketamin (120 mg/kg) og xylazine (16 mg/kg) ved hjælp af intraperitoneal ruten.</li>
		<li>Udfør hjertepunktering (figur 1),når musen ikke udviser muskelreaktion som reaktion på forskellige fysiske stimuli (f.eks. tå- og haleklemmer).</li>
		<li>Blod opsamlingsblod med en steril 1 ml sprøjte med en 27 G x 1/21 /21 /(0,4 x 12 mm2)nål, der indeholder 100 μL 1 mg/ml heparin (natriumsalt) for at forhindre dannelse af blodpropper. Blod ved 37 °C med vandbad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kunstig fodring<ol>
<li>Indsamle ca 30 kvindelige myg fra bestanden bur ved hjælp af en aspirator.</li>
		<li>Overfør de kvindelige myg til 500 ml papir kopper og dække med en fin myggenet mesh, så de ikke kan undslippe. Påfør en glasføder, der er tilsluttet plastrør, for at opretholde en konstant vandgennemstrømning til toppen af hver kop (figur 2). Sørg for en konstant vandgennemstrømning til cylindriske slanger og foderautomater, så temperaturen inden for holdes ved ca. 37,5 °C. BEMÆRK: En standard glasklokke kunstig fodring apparat16 blev brugt til at levere den formulerede kost til kvindelige myg.</li>
		<li>Stretch paraffin film membran på tværs af mundingen af glas feeder til at indeholde måltidet.</li>
		<li>Varm i-liq_diet og r-liq_diet ved 37 °C ved hjælp af et vandbad. Påfør 1 ml i glasføderen. Fodre myg i 60 min i mørke med enten i-liq_diet, r-liq_diet eller frisk mus blod. Udfør analyser ved 26 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluering af fodringsraten.<ol>
<li>Efter kunstig fodring, kold-bedøve myg på -20 °C for 30 s. Placer myg i en nedkølet petriskål.</li>
		<li>Registrer antallet af fuldt engorged(Figur 3)kvindelige myg. BEMÆRK: Procentdelen af fodrede myg bruges som en proxy for fodring succes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Livshistoriske træk
<ol><li>Ægproduktion og frugtbarhed<ol>
<li>Overfør de fuldt engorged hunner, ved hjælp af en pensel, til de enkelte bure (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Opbevar myggene ved 26 ± 1 °C, 75% fugtighed og en 12 h:12 h lys:mørk cyklus med 10% glukose ad libitum.</li>
		<li>48 timer efter fodringen, tilsæt et befugtet filterpapir i bunden for æglægning (Figur 4). Tæl æggene ved 48 timer og 72 timer efter tilsætning af æglæggende papir ved hjælp af et håndholdt forstørrelsesglas. Overfør filterpapiret med destilleret vand for at indsamle æggene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larver dødelighed<ol>
<li>Æggene samles i bakker (23 cm x 15 cm x 6 cm) fyldt med destilleret vand (figur 5). Opretholde vandstanden i bakkerne konstant under forsøgene.</li>
		<li>Fodre larver dagligt med ca. 13 mg hakket fiskefoder pr. bakke. Påfør en lignende fodringsordning på alle replikatbakkerne.</li>
		<li>Fjern døde pupper og larver dagligt. Færdiggøre eksperimenter, når alle pupper har udviklet sig til voksne og tælle antallet af voksne mænd og kvinder.</li>
		<li>Registrer datoerne for udklækning og død, og beregn dødeligheden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Levetid<ol>
<li>Saml 15 voksne mænd og 15 voksne hunner fra F1 generation af hver kost gruppe. Hold hanner og hunner i samme bur.</li>
		<li>Feed voksne med en 10% glukose løsning ad libitum. Fjern de døde voksne dagligt.</li>
		<li>Vedligehold myggene ved samme temperatur, fugtighed, lyscyklusforhold og sukkerfodring sregime som beskrevet ovenfor.</li>
		<li>Registrer dødsdatoerne, og beregn levetiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Måling af vingelængde<ol>
<li>Kold-bedøve fem-dages gamle F1 voksne myg (mand og kvinde) fra hver kost gruppe på -20 °C for 90 s.</li>
		<li>Under et stereoskop, forsigtigt forstå brystkassen af hver myg med pincet og placere dem ventrale side op.</li>
		<li>Saml begge vinger ved hjælp af en skalpel og læg dem på et rent mikroskop dias, der indeholder en tørret dråbe montering medium. Ved hjælp af en 20 G nål tilføje ekstra montering medier til grænserne for dæksrids og langsomt sænke dæksel på vingerne.</li>
		<li>Mål vingelængden (figur 6) med et stereoskop ved hjælp af et mikrometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2016).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).</li><li>Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+technologies+to+induce+sterility.">Transgenic technologies to induce sterility.</a> Malaria Journal. 8, 7 (2009).</li><li>Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+applications+of+induced+sterilisation+in+field+populations+of+mosquitoes.">Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes.</a> Malaria Journal. 8, 2 (2009).</li><li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+Field+Release+of+Genetically+Engineered+Sterile+Male+Aedes+aegypti+in+Malaysia.">Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia.</a> PLoS One. 7, 42771 (2012).</li><li>Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Preliminary+Note+on+Egg+Production+from+Milk-Fed+Mosquitoes.">A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes.</a> The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).</li><li>Kogan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).</li><li>Griffith, J. S., Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+with+a+blood+substitute+diet+for+the+females.">Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females.</a> Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).</li><li>Jason Pitts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-free+protein+meal+supporting+oogenesis+in+the+Asian+tiger+mosquito,+Aedes+albopictus+(Skuse).">A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse).</a> Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).</li><li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+serum+and+BSA,+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti.">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938 (2015).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Diets+for+Mosquitoes.">Artificial Diets for Mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267 (2016).</li><li>Cosgrove, J. B., Wood, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+variations+in+a+formulated+protein+meal+on+the+fecundity+and+fertility+of+female+mosquitoes.">Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes.</a> Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -. H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signalling+during+mosquito+reproduction.">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction.</a> Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , (1992).</li><li>Talyuli, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+chemically+defined+artificial+diet+as+a+tool+to+study+Aedes+aegypti+physiology.">The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology.</a> Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).</li><li>Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii:+The+effect+of+second+blood+meal+and+anti-sporozoite+antibodies+on+development+and+gene+expression+in+the+mosquito+vector,+Anopheles+stephensi.">Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi.</a> Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).</li><li>Phasomkusolsil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mosquito+vectors:+effects+of+blood+source+on+feeding,+survival,+fecundity,+and+egg+hatching+rates.">Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates.</a> Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).</li><li>Gillies, M. T., De Meillon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anophelinae+of+Africa+South+of+the+Sahara+(Ethiopian+zoogeographical+region).">The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region).</a> Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).</li><li>Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+in+insects.">Fat metabolism in insects.</a> Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).</li><li>Clifton, M. E., Noriega, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+follicles+after+a+blood+meal+is+dependent+on+previtellogenic+nutrition+and+juvenile+hormone+in+Aedes+aegypti.">The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+SkitoSnack,+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota.">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8, 11023 (2018).</li><li>Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+nitric+oxide+and+transforming+growth+factor-beta1+in+malaria.">Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria.</a> Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).</li><li>Sumba, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oviposition+patterns+of+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+Giles+(Diptera:+Culicidae)+on+different+types+of+aqueous+substrates.">Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates.</a> Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Succesen med vores formulerede blodfri kost er sandsynligvis et resultat af den synergistiske fysiologiske effekt af alle komponenter tilsættes i-liq_diet (rig på sukker, aminosyrer, vitaminer og mikroelementer): BSA (protein kilde), ATP (phagostimulant) og kolesterol (lipid kilde). Tilskud af r-liq_diet med de enkelte komponenter alene var ikke effektiv til at stimulere ægproduktion (data ikke vist). En ulempe ved protokollen kan være omkostningerne ved nogle af komponenterne, såsom kolesterol. Alligevel, dens tilstedeværelse er grundlæggende, som insekter er ude af stand til at syntetisere det19 og dette molekyle er forløberen for ecdysteroidhormoner, der regulerer æggeblomme syntese og æg modning i leddyr20. Lavere mængder af kolesterol bør testes for at optimere den mængde, der er nødvendig med henblik på at reducere omkostningerne og øge fordelene ved den kunstige kost.
En anden begrænsning af metoden er, at den kunstige kost skal være frisklavet af lageropløsninger, som når den er fremstillet i sin endelige flydende form, mister den kvalitet efter opbevaring. I fremtiden vores formulerede kost kunne fremstilles som en tørret magt, svarende til SkitoSnackt, en kunstig blod måltid erstatning for Aedes aegypti myg21.
Udover at levere de nødvendige næringsstoffer, et kunstigt måltid skal tiltrække og stimulere kvindelige myg til foder på samme måde, som når de lever af hvirveldyr frisk blod. Den kunstige blodfri kost heri beskrevet resulterede i en 20% stigning i fuldt engorged kvindelige myg i forhold til hvirveldyr blod fodret gruppe. Denne indirekte mål for tiltrækning kunne præciseres yderligere ved at bruge olfactometers til at bekræfte, at den kunstige kost er mere attraktiv og mere tiltrækkende for myg end frisk blod.
Den højeste virkning af kosten på larve dødelighed blev observeret for larver stammer fra myg fodret med blod, hvilket tyder på, at en kunstig kost af stabil sammensætning kan bidrage til at reducere dødeligheden og forbedre myg avl succes i forhold til frisk blod. Det mindre forudsigelige resultat af et blodmåltid kan opstå som følge af værtsvariationer i sammensætning17 og tilstedeværelsen i blodet af molekyler, der kan forstyrre mygfysiologi22. De foregående fakta understrege fordelene for høj kvalitet myg opdræt af frisk blod-fri kost.
Samlet set var det gennemsnitlige antal æg, der blev lagt i vores undersøgelse, lavt i forhold til dem, der blev rapporteret hos nogle insektæke, men det gennemsnitlige antal æg, der var fremstillet af ovipositeæg, var sammenligneligt med den A. gambiae laboratorieopdrættede stamme, der blev fodret med humant blod (22,6 ± 5,5 æg/hunn)23. Der blev ikke observeret væsentlige statistiske forskelle mellem vores eksperimentelle grupper, der blev fodret med enten frisk blod eller på de kunstige måltider (tabel 2), hvilket tyder på, at implementeringen af et kunstigt membranfodringssystem med vores formulerede kost er tilstrækkelig til at vedligeholde og udbrede Anopheles mygkolonier i fangenskab.
Kunstige blod-fri måltider kan opretholde Aedes kolonier 22,men når de anvendes til Anopheles myg de er af begrænset eller ingen succes11. For nylig, en plasma-baseret kunstigt måltid for Anopheles myg blev beskrevet24, men fodring satser og reproduktive potentiale var lav. Vores resultater repræsenterer et betydeligt fremskridt i state-of-art (gennemgået af Gonzales og Hansen11)som vores formulerede r-liq_diet havde en lignende eller bedre ydeevne end standard hvirveldyr blodmåltid. Yderligere forbedringer af lagerstabiliteten og omkostningerne bør udvide anvendelsesområdet.

Vektorbårne sygdomme påvirker flere millioner mennesker på verdensplan og forårsager millioner af dødsfald hvert år. De overføres af insekter inficeret med sygdomsproducerende mikroorganismer (protozoer, vira), der erhverves, når de lever af blod fra en inficeret vært. Efterfølgende vil den inficerede vektor overføre patogenet til en ny vært under det næste blodmåltid. Malaria er den dødeligste vektorbårne sygdom, der overføres af flere forskellige arter af Anopheles myg og påvirker 40% af verdens befolkning1. Malaria protist parasit er ansvarlig for mere end 400.000 dødsfald hvert år, hvoraf de fleste er børn under 5 år (Verdenssundhedsorganisationen). Den kvindelige Anopheles myg overfører malaria parasit af Plasmodium slægten mellem mennesker og andre dyr, når det lever af hvirveldyr blod, et nødvendigt skridt for ægproduktion og udvikling2.
Nuværende strategier for udryddelse af malaria og andre nye dødbringende myg vektor-bårne sygdomme er afhængige af udviklingen af innovative myg kontrol strategier3,4,5, som omfatter frigivelse i naturen af et stort antal myg opdrættet i insektæle. Men en afgørende begrænsende faktor er afhængigheden af en levering af frisk blod til effektiv myg opdræt og avl. Den variable sammensætning af hvirveldyr blod kan have en negativ indvirkning myg frugtbarhed og afkom fitness og kan begrænse pålideligheden og bæredygtigheden af fangenskab avl kolonier. Mosquito frigivelse og kontrol programmer kræver store myg produktionssystemer og en regelmæssig forsyning af store mængder af hvirveldyr blod. Dette er en væsentlig hindring for myg produktion og rejser en række etiske spørgsmål i forbindelse med brugen af levende dyr og logistiske begrænsninger forårsaget af de dermed forbundne krævende sikkerhedsbestemmelser. Dette gør omkostningerne ved vedligeholdelse og sikkerhed af myg kolonier høje og udfordrer bæredygtigheden af de nuværende myg opdræt praksis især i lavindkomstlande, hvor truslen om malaria er langt større.
For nylig forskning har været fokuseret på udviklingen af blod erstatninger, der efterligner en hvirveldyr blodmåltid, men hidtil, kun begrænset succes er opnået6,7,8,9. En vellykket kunstig kost skal (1) provokere fuld kvindelig myg engorgement, (2) udløse vitellogenin produktion, (3) producere store partier af levedygtige æg, og (4) generere hedenske afkom10. Desuden har kunstig kost en standard sammensætning og dermed er mere pålidelige til produktion af myg til forsknings- og kontrolformål. Vellykket blodfri kost er blevet udviklet til Aedes myg (anmeldt af Gonzales og Hansen11),men ikke for Anopheles spp. Eksisterende kunstige kostvaner indeholder en phagostimulant (f.eks ATP10),en proteinkilde til ægmodning6,12, kulhydrater som energikilde, og aminosyrer (aa)13, der er grundlæggende for ægproduktion og er en vigtig begrænsende faktor for myg frugtbarhed14. En kunstig blodfri kost også nødt til at give kolesterol15, hvilket forbedrer ægproduktion. Her beskriver vi en kunstig blodfri kost for kvindelige Anopheles myg og viser, at det har en konsekvent og tilsvarende ydelse til en høj kvalitet hvirveldyr blodmåltid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A790G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>199342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (high glucose with L-glutamine)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan mounting medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1079610100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassfeeder</td>
			<td>Local glazier</td>
			<td>by design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Pan Reac AppliChem</td>
			<td>A3004,0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td>Merial, Portugal</td>
			<td>01MER122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G x 1&#34; 0.9 x 25 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer, Portugal</td>
			<td>7427831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Millex-HV 0,45</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR25KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1ml, 27 G x &#189;&#34; 0.4 x 12 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>BS-NIN2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teich Mix Astra Pond</td>
			<td>Astra</td>
			<td>4030733100957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Flakes</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4004218742642</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes

Malaria forskning kræver store avl og produktion betingelser for myg(Anopheles spp.) i fangenskab. Den bæredygtige og pålidelige produktion af myg er i øjeblikket hæmmet af levering af frisk hvirveldyr blod. Alternativer til blod er nødvendige for at fremme effektive kontrolstrategier for malaria og andre vektorbårne sygdomme, der overføres af blodfodring insekter. Med dette i tankerne, kunstige flydende kost vaner blev formuleret som erstatninger for frisk hvirveldyr blod. Heri rapporterer vi en blodfri kunstig flydende kost, der leverer fodring satser svarende til blod og efterligner de fysiologiske virkninger af en frisk hvirveldyr blodmåltid. Kosten inducerer æggestokkene og æg modning af Anopheles myg og producerer også god larve overlevelse og udvikling af funktionelle voksne. Den formulerede blodfri flydende kost er et vigtigt fremskridt i retning af bæredygtig myg avl i fangenskab og vil reducere vedligeholdelsesomkostningerne for myg kolonier og fjerne behovet for frisk hvirveldyr blod.

De resultater, der er beskrevet nedenfor sammenligne udførelsen af kvindelige Anopheles myg fodret med den formulerede rige kunstige måltid (r-liq_diet) og myg fodret med den oprindelige flydende kost (i-liq_diet) eller et frisk blod måltid. Kosten blev testet efter den skematiske protokol, der er afbildet i figur 7. Den r-liq_diet beskrevet heri er en del af et patent (PCT/IB2019/052967).
Procentdel af fuldt engorged hunner
Antallet af engorged kvindelige myg fodret med r-liq_diet (89%) var betydeligt højere end antallet af engorged hunner fodret med blod (56%) (Figur 8).
Frugtbarhed og frugtbarhed
Kvindelig frugtbarhed og frugtbarhed for den første gonotrofisk cyklus blev brugt til at vurdere den ernæringsmæssige kvalitet af i-liq_diet og r-liq_diet. I gennemsnit 24 ± 11 æg blev lagt af hunner, der fodres med frisk hvirveldyrsblod, mens hunner, der fodres med r-liq_diet, i gennemsnit lagde 25 ± 5 æg (tabel 2). Der blev ikke observeret æglægning af hunner, der blev fodret med i-liq_diet.
F1 dødelighed
Egnethed F1 myg blev evalueret mellem kolonier fodret med hvirveldyr blod eller r-liq_diet. Larver, pupper og voksne dødelighed blev registreret. Variabilitet (standardfejl i middelværdien [SEM]) var højere i de blodfodrede myg(figur 9 og tabel 2)i forhold til myg, der fodres med r-liq_diet. F1 generation af myg fodret med enten blod eller r-liq_diet havde sammenlignelige dødelighed og overlevelsesrater.
F1 forventet levetid
Det anslås af Center for Disease Control og Forebyggelse, at vilde voksne kvindelige myg lever i op til en måned, men sandsynligvis ikke overleve i mere end 1−2 uger, og at mænd lever i omkring en uge og lever udelukkende på nektar og andre sukkerkilder. Det bemærkes, at forskelle i forældrenes fødeindtagelse kan påvirke overlevelsen af myg afkom17. I vores forsøg havde voksne hunner og hanner i blodet (hunnen 24,5 ± 6,8; han18,5 ± 6,9) og r-liq_diet (kvinder: 22,5 ± 8,1; han: 11,9 ± 6,9) grupper et tilsvarende gennemsnitligt gennemsnit for forventet levetid (tabel 3) og hunner viste en øget levetid i forhold til hannerne.
F1 kropsstørrelse
Vingelængde blev brugt som indikator for voksen kropsstørrelse. Sammenlignet med andre arter, Anopheles voksne er små til mellemstore myg med en vingelængde på mellem 2,8 til 4,4 mm vingelængde18. Voksen kropsstørrelse af F1 Anopheles myg fodret r-liq_diet var inden for det forventede interval og svarede til blod-fodret insektmyg(Figur 10).
Statistisk analyse
De fremlagte data udgør et gennemsnit af mindst tre uafhængige forsøg (medmindre andet er angivet). Fejllinjer repræsenterer SEM'en. Når data fulgte en gaussisk distribution, uafhængige grupper blev sammenlignet ved hjælp af Student's t test, ellers Mann-Whitney test blev anvendt. Forskellene mellem de kunstige kostfodrede grupper blev analyseret ved hjælp af Fishers nøjagtige test og blev anset for at være signifikante ved P ≤ 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> Figur 1: CD1-mus blodtapning ved intracardiac punktering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> Figur 2: Standard kunstigt fodringsapparat. Glasføder indeholder r-liq_diet, der bliver fodret til kvindelige Anopheles myg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> Figur 3: Anopheles myg efter kunstig fodring. Fra venstre mod højre: en fuldt engorged kvinde, der blev tilbudt r-liq_diet, ikke-engorged kvinde, der blev tilbudt r-liq_diet, mandlige, og fuldt engorged kvinde, der blev tilbudt museblod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> Figur 4: Anopheles æg lagt 48 h efter fodring af hunner med r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> Figur 5: L2 larver faser, der er udviklet fra æggene og blev indsamlet på filterpapir og placeret i bakker, der indeholder destilleret vand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> Figur 6: Højre fløj fra en F1 generation af en Anopheles coluzzii kvindelige myg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> Figur 7: Skematisk protokol for test af kunstig kost. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> Figur 8: Fodring satser af de kvindelige myg fodret enten den kunstige kost eller blod. Stjerner indikerer betydelige forskelle mellem mygfodret r-flydende og i-flydende kost og blod-fodret kontrolgruppe. Tosidet Fishers nøjagtige test: ****P ≤ 0,0001 (relativ risiko: 0,4828, 95% selvsikker niveau [CL]: 0,3776 til 0,6194) for r-flydende kost versus blod, *P = 0,0335 (relativ risiko: 1,379, 95% CL: 1,044 til 1,836) for blod versus i. Blå: ufodret; rød: fodret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> Figur 9: Virkningen af det formulerede blodfrit måltid på dødeligheden og forholdet mellem mænd og kvinder og f1 Anopheles coluzzii-myg. Tre uafhængige eksperimenter blev udført, hver ved hjælp af 30 myg pr kost. En ikke-parret t-test viste ingen signifikante forskelle mellem blod-fodret gruppe og r-liq_diet fodret gruppe (P værdier varierede fra 0,5047 til 0,8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> Figur 10: Vingelængde. Afstanden fra det aksiale snit til R4+5 venen eksklusive frynser seta blev brugt til at bestemme vingelængden. Størrelsen blev evalueret for 5 hunner og 5 hanner fra hver kostgruppe (gennemsnitlig ± SEM). Værdierne er repræsenteret som den gennemsnitlige ± SEM. Laks: r-liq_diet; rød: hvirveldyr blod. Ikke-parret t-test; kvindelig venstre fløj: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; mandlige venstre fløj: t = 2.400, df = 8, P = 0,0432; kvindelig højrefløj: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; mandlige højre fløj: t = 2,277, DF = 7, P = 0,0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponenter</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>* Adenosin triphosphat</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Kvæg Serum Albumin</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>* Kolesterol</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calciumchlorid vandfri</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cholinchlorid</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-calcium pantothenate (vitamin B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glukose vandfri</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ferrinitrat nonahydrat</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Folinsyre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycin</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-inositol</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-arginin monohydrochlorid</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-cystin dihydrochlorid</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-histidin monohydrochlorid monohydrat</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-leucin</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-lysinmonohydrochlorid</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-methionin</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-phenylalanin</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-serine</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-threonine</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tyrosin dinatriumsalt dihydrat</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-valine</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumsulfat vandfri</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niacinamid (nicotinamid)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phenol rød</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaliumchlorid</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyridoxine Monohydrochlorid</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyruvicsyre natriumsalt</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riboflavin (vitamin B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumbicarbonat</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumchlorid</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfat monobasic vandfri</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamin amonohydrochlorid (vitamin B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* Kun i r-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Sammensætningen af den i-flydende kost og r-flydende kost.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Ægtal i alt (± SEM)</td>
			<td>Æg/kvinde (± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blod</td>
			<td>733 ± 330</td>
			<td>24 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 ± 164</td>
			<td>25 ± 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Æg partier produceret af Anopheles coluzzii hunner. Tre uafhængige eksperimenter blev udført for hver eksperimentel kost ved hjælp af 30 kvindelige myg i hver.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Hunner (dage ± SEM)</td>
			<td>Hanner (dage ± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blod</td>
			<td>24,5 ± 6,8</td>
			<td>18,5 ± 6,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22,5 ± 8,1</td>
			<td>11,9 ± 6,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Forventet levetid for F1 Anopheles myg. Levetiden for F1 myg fra kunstigt fodret F0 blev vurderet ved at registrere fødselsdatoer og død af hver myg, der kommer fra samme kostgruppe (15 kvinder og 15 mænd blev fulgt). Resultaterne er repræsenteret som den gennemsnitlige myg levetid per kost gruppe.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

En protokol præsenteres for formulering af en blodfri kunstig kost til foder Anopheles myg i fangenskab. Denne kost har en lignende præstation til hvirveldyr blod og udløser oogenesis og æg modning og producerer levedygtige voksne afkom.

En blodfri kost til bageste Anopheline Myg

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Malaria parasitter såsom mødt af myg, der spiller en stor rolle på spredningen af sygdommen. Hidtil har det været umuligt at opdrætte malaria myg uden blod. Og for at overvinde denne begrænsning, vores protokol beskriver en blod erstatning kost, der er i stand til at støtte myg avl i insekthistorie.Brugen af blodfri kost er meget fordelagtig over blod. En blodfri kost ikke har de etiske begrænsninger som brug af menneskeblod, eller eksperimentelle dyr. Udskiftning af dyr på forsøg er en del af vores tre R-politik.Erstat, reducer, forfine. Ikke at bruge blod reducerer omkostningerne, og logistikken i forbindelse med indsamling, opbevaring og vedligeholdelse af rødt blod. Brugen af kunstig kost kan lette test af anti plasmodium molekyler.Indtil nu har vi testet vores kost ved hjælp af forskellige anopheles arter. I dem alle, kosten var godt engorged af hunnerne og tilladt ægproduktion og æglægning. Vi mener, at denne kost har potentiel brug for opdræt af andre myg arter.Faktisk er vi nu teste det for aedes, en vektor af mange sygdomme som dengue feber, zika virus, eller gul feber. Opretholde anopheles coluzzii yaonde stamme myg i et rum ved 26 grader Celsius, 75% fugtighed, og under en 12 timer til 12 timers lys mørk cyklus. House myg ved hjælp af standard insektærgning betingelser i et enkelt bur for at sikre parring.Brug en plastik pipette til at indsamle myg pupper i en lille vandbeholder. Placer beholderen inde i en myg bur for at lade voksne myg dukke op og parre sig. Giv 10% glukose fodring løsning i buret.Tre dage efter fremkomsten, bruge en aspirator til at indsamle det nødvendige antal hunner fra bestanden buret i et papir kop. At skelne, hunner er større og hanner har en bredere og fjerklædte snabel. En dag før fodring stier, fjerne 10% glukose fodring løsning.Den næste dag, forberede kunstige flydende kost under sterile forhold i laminar flow kabinet i henhold til manuskriptet. Tilsæt alle ingredienser til et plastrør. Bland alle ingredienser grundigt og filtrer ved hjælp af et 0,45 mikron mikrofilter.Fyld en steril 1 milliliter sprøjte udstyret med en 27 gauge halv tomme nål med 100 mikroliter af en milligram pr milliliter heparin. Derefter bedøve seks til otte uger gamle CD en hun mus med ketamin og xylazine ved hjælp af intra bughindevej. Vurdere, om musen viser nogen muskel reaktion og reaktion på forskellige fysiske stimuli.Udfør hjertepunkteringen. Derefter indsamle blod fra musen i et mikrorør og vedligeholde blod ved 37 grader Celsius i et vandbad. Dernæst indsamle ca 30 kvindelige myg fra bestanden buret ved hjælp af en aspirator.Overfør de kvindelige myg til 500 milliliter papir kopper og dække med en fin myggenet mesh, så de ikke kan undslippe. Stræk parafilmmembranen hen over mundingen af glasføderen for at indeholde måltidet. Påfør en glasklokke kunstig fodring apparat forbundet til plastrør til toppen af hver kop.Giv en konstant vandgennemstrømning til den cylindriske slange og føder, så temperaturen inden holdes på omtrentlige 37,5 grader Celsius. Påfør en milliliter forvarmet flydende kost ved 37 grader Celsius eller frisk museblod i en glasføder. Fodre myg i 60 minutter i mørke i 26 grader Celsius.Efter kunstig fodring, kold bedøvelse myggene ved 20 grader Celsius i 30 sekunder. Derefter placere myg i en nedkølet petriskål. Optag antallet af fuldt engorged kvindelige myg.Adskærg 30 fuldt engorged hunner og læg dem på et nyt bur. Nu placere en befugtet filterpapir i bunden af hvert bur. Hold myg på 26 grader Celsius, 75% luftfugtighed, og under en 12 timer til 12 timers lys mørk cyklus med 10% glukose ad libitum.Ved 96 timer og 120 timer efter fodring, tælle æggene ved hjælp af en håndholdt forstørrelsesglas. Flood filterpapiret med destilleret vand for at samle æggene i bakker fyldt med destilleret vand. Fodre larver dagligt med ca 13 milligram jord fisk mad pr bakke.Fjern døde pupper og larver med en plastik pipette dagligt. Når alle pupper har udviklet sig til voksne, tælle antallet af voksne mænd og hunner, registrere datoerne for udklækning og død, og beregne dødeligheden. At teste for lang levetid, indsamle 15 voksne mænd og 15 voksne kvinder fra F1 generation af hver kost gruppe i et papir kop.Feed voksne med 10% glukose løsning ad libitum. Brug en pincet eller en børste til at fjerne de døde voksne dagligt. Vedligehold myggene ved samme temperatur, fugtighed, lyscyklusforhold og sukkerfodring.Registrer dødsdatoerne, og beregn levetiden. At måle vingelængde, kold bedøvelse fem dage gamle F1 mandlige og kvindelige voksne myg fra hver kost gruppe ved 20 grader Celsius i 90 sekunder. Under et stereoscope, forsigtigt gribe brystkassen af hver myg med stænt, og placere dem ventrale side op.Saml begge vinger ved hjælp af en skalpel, og læg dem på en ren mikroskop dias, der indeholder en tørret dråbe montering medium til yderligere måling ved hjælp af en gradueret okular. Mål vingelængden med et stereoanlæg ved hjælp af et mikrometer. I denne undersøgelse, udførelsen af kvindelige anopheles myg fodret med den formulerede rige kunstige måltid og myg fodret med den oprindelige flydende kost, eller en frisk blod måltid blev sammenlignet.Antallet af engorged kvindelige myg fodret med rige kunstige måltid på 89% var betydeligt højere end antallet af engorged kvinder fodret med blod på 56% F1 generation af myg fodret med enten blod eller den rige kunstige måltid havde sammenlignelige dødelighed og overlevelsesrater. Variabilitet var højere i blodet fodret myg i forhold til myg fodret med den rige kunstige måltid. Med hensyn til voksne kropsstørrelse, F1 anopheles myg fodret med rige kunstige måltid var inden for det forventede interval, og svarede til blod fodret insektære myg.Efter min mening er det meget vigtigt at samle foderautomater ordentligt med parafilm for at undgå det brud. Hvis membranen ikke er godt fastgjort til glasføderen, kan du miste måltidet og sandsynligvis miste nogle af myggene, da de kan være dækket af måltidet og dø. Vi vil gerne udføre en dobbelt valg attraktion assay, for eksempel ved hjælp af en olfactometer, så vi rent faktisk kunne vurdere, om vores kvinder er mere tiltrukket af den kunstige kost eller til blodet.Også, vi er nu lyophilizing den kunstige kost og studere det stabilitet blandt forskellige temperaturer i lang tid. Ud over de åbenlyse forbedringer af stabilitet og opbevaring, som vi har arbejdet på, bør den langsigtede brug af kosten på myg fitness og fysiologi undersøges. Jeg tror, at producere anopheles uden blod vil lette umådeligt vektor forskning og gennemførelse af kontrolværktøjer, der er afhængige af et stort antal myg.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-påvisningsassay for Malaria Fremsendende Myg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Opretholdelse af Aedes aegypti myg inficeret med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Den Murine cholin-mangelfuld, Ethionine-suppleret (CVU) kost Model af kronisk leverskade

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for afprøvning toksicitet af roman insektbekæmpelsesmidler kemi til myg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...