Name: a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Ringraziamo Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) per il supporto tecnico Joana Gomes e Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) per il mantenimento delle colonie di zanzare di Anopheles. Finanziato dalla Bill and Melinda Gates Foundation (OPP11138841), Fundao para a Ciància e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

I topi sono stati ottenuti dalla casa degli animali Dell'HMT. Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in stretta conformità con la legge portoghese e le linee guida per l'uso di animali da laboratorio. Il Terribile-Geral de Veterin'ria, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, portogallo ha approvato tutti i protocolli di studio (id approvazioni: 023351 e 023355).
NOTA: Eseguire tutti i asino di alimentazione a 26 gradi centigradi.
1. Mosquitoes
<ol><li>Mantenere Anopheles coluzzii (ex forma di Anopheles gambiae M) Yaoundé ceppo zanzare a 26 gradi C, 75% di umidità sotto un 12 h:12 h ciclo di luce:scuro. Le zanzare domestiche che utilizzano condizioni insettiche standard per garantire l'accoppiamento.</li>
	<li>Raccogliere pupe di zanzara in un piccolo contenitore d'acqua. Posizionare il contenitore all'interno di una gabbia di zanzare per far emergere e accoppiare le zanzare adulte. Fornire 10% soluzione di alimentazione del glucosio. Tre giorni dopo l'emergere raccogliere il numero necessario di zanzare dalla gabbia di riserva utilizzando un aspiratore.</li>
	<li>Un giorno prima delle prove di alimentazione, rimuovere la soluzione di alimentazione del glucosio del 10%. NOTA: nel corso degli esperimenti sono state utilizzate 3 zanzare di un giorno.</li>
</ol>2. Alimentazione delle zanzare
<ol><li>Preparazione di diete liquide artificiali<ol>
<li>Preparare le diete liquide artificiali in condizioni sterili in un armadio a flusso laminare. Preparare la ricca dieta liquida (r-liq_diet) aggiungendo quanto segue alla dieta liquida iniziale (i-liq_diet; Il mezzo di Dulbecco modificato di Eagle [alto glucosio con L-glutamine], vedi Tabella 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L di colesterolo e 200 g/L di siero bovino albumina (BSA). Mescolare accuratamente tutti gli ingredienti e filtrare utilizzando un microfiltro da 0,45 m. NOTA: Non conservare le diete; preparare le diete appena dalle soluzioni stock per ogni esperimento in quanto perdono qualità quando vengono immagazzinate. I componenti delle diete sono descritti nella Tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccolta del sangue di topo<ol>
<li>Anestesizzai di 6-8 settimane di topi femminili CD1 (Mus musculus) con ketamina (120 mg/kg) e xylazina (16 mg/kg) utilizzando il percorso intraperitoneale.</li>
		<li>Eseguire la puntura cardiaca (Figura 1) quando il mouse non visualizza alcuna reazione muscolare in risposta a diversi stimoli fisici (ad esempio, pizzichi di punta e coda).</li>
		<li>Raccogliere il sangue utilizzando una siringa sterile da 1 mL con un ago da 27 G x 1x (0,4 x 12 mm2)che contiene 100 - L di 1 mg/mL di eparina (sale di sodio) per prevenire la formazione di coaguli di sangue. Mantenere il sangue a 37 gradi centigradi con un bagno d'acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentazione artificiale<ol>
<li>Raccogli circa 30 zanzare femmine dalla gabbia di riserva usando un aspiratore.</li>
		<li>Trasferire le zanzare femminili a tazze di carta da 500 mL e coprire con una rete di zanzariere fine in modo che non possano fuggire. Applicare un alimentatore di vetro collegato a tubi di plastica per mantenere un flusso d'acqua costante verso la parte superiore di ogni tazza (Figura 2). Fornire un flusso d'acqua costante al tubo cilindrico e all'alimentatore in modo che la temperatura all'interno sia mantenuta a circa 37,5 gradi centigradi. NOTA: Un apparato di alimentazione artificiale campana di vetro standard16 è stato utilizzato per fornire le diete formulate alle zanzare femminili.</li>
		<li>Allungare la membrana della pellicola di paraffina sulla bocca dell'alimentatore di vetro per contenere il pasto.</li>
		<li>Preriscaldare l'i-liq_diet e r-liq_diet a 37 gradi centigradi con un bagno d'acqua. Applicare 1 mL nell'alimentatore di vetro. Nutrire le zanzare per 60 min al buio con i-liq_diet, r-liq_diet o sangue di topo fresco. Eseguire i saggi a 26 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valutazione del tasso di alimentazione.<ol>
<li>Dopo l'alimentazione artificiale, anestesizzare a freddo le zanzare a -20 gradi centigradi per 30 s. Posizionare le zanzare in una parabola Petri refrigerata.</li>
		<li>Registrare il numero di zanzare femmine completamente innestate(Figura 3). NOTA: La percentuale di zanzare nutrite viene utilizzata come proxy per il successo dell'alimentazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tratti della storia della vita
<ol><li>Produzione e fertilità di uova<ol>
<li>Trasferire le femmine completamente innestate, utilizzando un pennello, a singole gabbie (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Mantenere le zanzare a 26 : 1 C, 75% di umidità e un 12 h:12 h ciclo di luce:scuro con 10% di glucosio ad libitum.</li>
		<li>Quarantotto h dopo l'alimentazione, aggiungere una carta da filtro umidificata sul fondo per la deposizione delle uova (Figura 4). Contare le uova a 48 h e 72 h dopo l'aggiunta della carta da deposizione delle uova utilizzando una lente di ingrandimento portatile. Allagare la carta da filtro con acqua distillata per raccogliere le uova.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mortalità delle larve<ol>
<li>Raccogliere le uova in vassoi (23 cm x 15 cm x 6 cm) riempiti con acqua distillata (Figura 5). Mantenere costante il livello dell'acqua nei vassoi durante gli esperimenti.</li>
		<li>Nutrire le larve ogni giorno con circa 13 mg di cibo di pesce macinato per vassoio. Applicare un regime di alimentazione simile a tutti i vassoi di replica.</li>
		<li>Rimuovere pupe morte e larve ogni giorno. Finalizzare gli esperimenti in cui tutte le pupe si sono sviluppate in adulti e contano il numero di maschi adulti e femmine.</li>
		<li>Registrare le date di schiusa e morte e calcolare i tassi di mortalità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Longevità<ol>
<li>Raccogli 15 maschi adulti e 15 femmine adulte dalla generazione F1 di ogni gruppo di dieta. Tenere maschi e femmine nella stessa gabbia.</li>
		<li>Nutrire gli adulti con una soluzione di glucosio al 10% ad libitum. Rimuovere gli adulti morti ogni giorno.</li>
		<li>Mantenere le zanzare alla stessa temperatura, umidità, condizioni del ciclo della luce e regime di alimentazione dello zucchero come descritto sopra.</li>
		<li>Registrare le date di morte e calcolare la longevità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurazione della lunghezza dell'ala<ol>
<li>Anestesizzare a freddo di cinque giorni le zanzare adulte di F1 (maschio e femmina) di ogni gruppo di dieta a -20 gradi centigradi per 90 s.</li>
		<li>Sotto uno stereoscopio, afferrare delicatamente il torace di ogni zanzara con pinze e metterli lato ventrale verso l'alto.</li>
		<li>Raccogliere entrambe le ali con un bisturi e metterle su un vetrino al microscopio pulito contenente una goccia secca di supporto di montaggio. Con l'aiuto di un ago da 20 G aggiungere un supporto di montaggio supplementare ai bordi della coverslip e abbassare lentamente la coverslip sulle ali.</li>
		<li>Misurare la lunghezza dell'ala (Figura 6) con uno stereoscopio utilizzando un micrometro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2016).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).</li><li>Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oviposition+patterns+of+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+Giles+(Diptera:+Culicidae)+on+different+types+of+aqueous+substrates.">Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates.</a> Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il successo della nostra dieta esente di sangue formulata è probabilmente il risultato dell'effetto fisiologico sinergico di tutti i componenti aggiunti all'i-liq_diet (ricco di zucchero, aminoacidi, vitamine e microelementi): BSA (fonte proteica), ATP (fagostico) e colesterolo (fonte lipidica). Il completamento dell'r-liq_diet con i singoli componenti da solo non è stato efficace nello stimolare la produzione di uova (dati non mostrati). Uno svantaggio del protocollo potrebbe essere il costo di alcuni dei componenti, come il colesterolo. Anche così, la sua presenza è fondamentale, in quanto gli insetti non sono in grado di sintetizzarlo19 e questa molecola è il precursore degli ormoni ecristeroidi che regolano la sintesi del tuorlo e la maturazione delle uova negli artropodi20. Minori quantità di colesterolo dovrebbero essere testate al fine di ottimizzare la quantità necessaria con l'obiettivo di ridurre i costi e aumentare i benefici della dieta artificiale.
Un'altra limitazione del metodo è che la dieta artificiale deve essere appena preparata da soluzioni di stock, come una volta preparata nella sua forma liquida finale perde qualità dopo lo stoccaggio. In futuro la nostra dieta formulata potrebbe essere preparata come potenza secca, simile a SkitoSnackt, un sostituto del pasto di sangue artificiale per Aedes aegypti zanzare21.
Oltre a fornire i nutrienti necessari, un pasto artificiale deve attirare e stimolare le zanzare femminili a nutrirsi allo stesso modo di quando si nutrono di sangue fresco vertebrato. La dieta artificiale priva di sangue qui descritto ha provocato un aumento del 20% in zanzare femminili completamente inghiottite rispetto al gruppo nutrito di sangue vertebrato. Questa misura indiretta di attrazione potrebbe essere ulteriormente chiarita utilizzando olfactometri per confermare che la dieta artificiale è più attraente e più attraente per le zanzare rispetto al sangue fresco.
L'impatto più alto della dieta sulla mortalità larvale è stato osservato per le larve derivate da zanzare alimentate con sangue, suggerendo che una dieta artificiale di composizione stabile può contribuire a ridurre la mortalità e migliorare il successo dell'allevamento delle zanzare rispetto al sangue fresco. L'esito meno prevedibile di un pasto di sangue può derivare da variazioni dell'ospite nella composizione17 e dalla presenza nel sangue di molecole che possono interferire con la fisiologia delle zanzare22. I fatti precedenti sottolineano i vantaggi per l'allevamento di zanzare di alta qualità di diete fresche senza sangue.
Nel complesso il numero medio di uova deposte nel nostro studio era basso rispetto a quelle riportate in alcuni insetti, ma il numero medio di uova oviposite era paragonabile al ceppo allevato in laboratorio A. gambiae nutrito con sangue umano (22,6 x 5 uova/femmina)23. Non sono state osservate differenze statistiche significative tra i nostri gruppi sperimentali alimentati con sangue fresco o pasti artificiali(Tabella 2),suggerendo che l'implementazione di un sistema di alimentazione a membrana artificiale con la nostra dieta formulata è sufficiente per mantenere e propagare le colonie di zanzare Anopheles in cattività.
I pasti artificiali senza sangue possono mantenere le colonie di Aedes 22, ma quando applicato alle zanzare Anopheles sono di limitato o nessun successo11. Recentemente, un pasto artificiale a base di plasma per le zanzare Anopheles è stato descritto24 ma i tassi di alimentazione e il potenziale riproduttivo erano bassi. I nostri risultati rappresentano un sostanziale progresso nello stato dell'arte (esaminato da Gonzales e Hansen11) in quanto la nostra formulata r-liq_diet ha avuto una prestazione simile o migliore rispetto al pasto di sangue vertebrato standard. Ulteriori miglioramenti sulla stabilità e sui costi di storage dovrebbero ampliare la portata della sua applicazione.

Le malattie trasmesse da vettori colpiscono diversi milioni di esseri umani in tutto il mondo e causano milioni di morti ogni anno. Sono trasmessi da insetti infettati da microrganismi che producono malattie (protozoi, virus) acquisiti quando si nutrono di sangue proveniente da un ospite infetto. Successivamente, il vettore infetto trasmetterà l'agente patogeno a un nuovo ospite durante il prossimo pasto di sangue. La malaria è la malattia trasmessa da vettori più letale che viene trasmessa da diverse specie di zanzare Anopheles e colpisce il 40% della popolazione mondiale1. Il parassita proista della malaria è responsabile di oltre 400.000 decessi ogni anno, di cui la maggior parte sono bambini sotto i 5 anni (Organizzazione Mondiale della Sanità). La zanzara femmina Anopheles trasmette il parassita della malaria del genere Plasmodium tra gli esseri umani e altri animali quando si nutre di sangue vertebrato, un passo necessario per la produzione e lo sviluppo delle uova2.
Le attuali strategie per l'eradicazione della malaria e di altre malattie mortali emergenti trasmesse da vettori di zanzara si basano sullo sviluppo di innovative strategie di controllo delle zanzare3,4,5, che includono il rilascio nel selvaggio di un gran numero di zanzare allevate in insetti. Tuttavia, un fattore limitante cruciale è la dipendenza da un apporto di sangue fresco per un allevamento e un allevamento efficaci delle zanzare. La composizione variabile del sangue dei vertebrati può avere un impatto negativo sulla fertilità delle zanzare e sulla forma fisica della progenie e può limitare l'affidabilità e la sostenibilità delle colonie riproduttive in cattività. I programmi di rilascio e controllo delle zanzare richiedono sistemi di produzione di zanzare su larga scala e una fornitura regolare di grandi quantità di sangue vertebrato. Si tratta di un grave ostacolo per la produzione di zanzare e solleva una serie di questioni etiche associate all'uso di animali vivi e limitazioni logistiche causate dalle norme di sicurezza esigenti associate. Ciò rende alti i costi di mantenimento e sicurezza delle colonie di zanzare e sfida la sostenibilità delle attuali pratiche di allevamento delle zanzare, in particolare nei paesi a basso reddito, dove la minaccia della malaria è di gran lunga maggiore.
Recentemente la ricerca si è concentrata sullo sviluppo di sostituti del sangue che imitano un pasto di sangue vertebrato, ma finora, solo un successo limitato è stato raggiunto6,7,8,9. Una dieta artificiale di successo deve (1) provocare l'ingorgo di zanzare femminili completo, (2) innescare la produzione di vitellogenina, (3) produrre grandi lotti di uova vitali e (4) generare progenie di pedice10. Inoltre, le diete artificiali hanno una composizione standard e quindi sono più affidabili per la produzione di zanzare a scopo di ricerca e controllo. Sono state sviluppate diete senza sangue di successo per le zanzare Aedes (recenstate da Gonzales e Hansen11)ma non per Anopheles spp. Le diete artificiali esistenti contengono un fagostimulante (ad esempio, ATP10),una fonte proteica per la maturazione delle uova6,12, carboidrati come fonte di energia, e aminoacidi (aa)13 che sono fondamentali per la produzione di uova e sono un importante fattore limitante per la fertilità delle zanzare14. Una dieta artificiale priva di sangue ha anche bisogno di fornire colesterolo15, che migliora la produzione di uova. Qui descriviamo una dieta artificiale priva di sangue per le zanzare femminili di Anopheles e dimostriamo che ha una prestazione costante ed equivalente a un pasto di sangue vertebrato di alta qualità.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A790G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>199342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (high glucose with L-glutamine)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan mounting medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1079610100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassfeeder</td>
			<td>Local glazier</td>
			<td>by design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Pan Reac AppliChem</td>
			<td>A3004,0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td>Merial, Portugal</td>
			<td>01MER122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G x 1&#34; 0.9 x 25 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer, Portugal</td>
			<td>7427831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Millex-HV 0,45</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR25KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1ml, 27 G x &#189;&#34; 0.4 x 12 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>BS-NIN2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teich Mix Astra Pond</td>
			<td>Astra</td>
			<td>4030733100957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Flakes</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4004218742642</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes

La ricerca sulla malaria richiede condizioni di riproduzione e produzione su larga scala per le zanzare(Anopheles spp.) in cattività. La produzione sostenibile e affidabile di zanzare è attualmente inibita dalla fornitura di sangue fresco di vertebrati. Sono necessarie alternative al sangue per promuovere strategie di controllo efficienti per la malaria e altre malattie vettoriali trasmesse dagli insetti che alimentano il sangue. Con questo in mente, le diete liquide artificiali sono state formulate come sostituti del sangue fresco dei vertebrati. Qui riportiamo una dieta liquida artificiale senza sangue che fornisce tassi di alimentazione simili al sangue e imita gli effetti fisiologici di un pasto fresco di sangue di vertebrati. La dieta induce la maturazione ovarica e delle uova delle zanzare Anopheles e produce anche una buona sopravvivenza larvale e lo sviluppo di adulti funzionali. La dieta liquida senza sangue formulata è un importante progresso verso l'allevamento sostenibile delle zanzare in cattività e ridurrà i costi di manutenzione delle colonie di zanzare ed eliminerà la necessità di sangue fresco di vertebrati.

I risultati descritti di seguito confrontano le prestazioni delle zanzare femminili anopheles alimentate con il ricco pasto artificiale formulato (r-liq_diet) e le zanzare nutrite con la dieta liquida iniziale (i-liq_diet) o un pasto di sangue fresco. La dieta è stata testata seguendo il protocollo schematico illustrato nella Figura 7. L'rc-liq_diet descritto qui fa parte di un brevetto (PCT/IB2019/052967).
Percentuale di femmine completamente inneste
Il numero di zanzare femmina inghiottite alimentate con r-liq_diet (89%) era significativamente superiore al numero di femmine ingozzate alimentate con sangue (56%) (Figura 8).
Fecondità e fertilità
La fecondità e la fertilità femminile per il primo ciclo gonotrofico sono state utilizzate per valutare la qualità nutrizionale dell'i-liq_diet e dell'r-liq_diet. Una media di 24 x 11 uova è stata deposta da femmine nutrite con sangue di vertebrato fresco, mentre le femmine nutrite di r-liq_diet deposto in media 25 x 5 uova (Tabella 2). Nessuna deposizione delle uova è stata osservata dalle femmine nutrite con l'i-liq_diet.
Mortalità F1
L'idoneità delle zanzare F1 è stata valutata tra colonie alimentate con sangue vertebrato o l'liq_diet R. Sono state registrate larve, pupe e mortalità adulta. La variabilità (errore standard della media [SEM]) era più alta nelle zanzare nutrite nel sangue(Figura 9 e Tabella 2)rispetto alle zanzare alimentate al r-liq_diet. La generazione di zanzare F1 si nutriva del sangue o del r-liq_diet aveva tassi di mortalità e sopravvivenza comparabili.
Aspettativa di vita F1
È stimato dal Centro per il controllo e la prevenzione delle malattie che le zanzare femmine adulte selvatiche vivono fino a un mese, ma probabilmente non sopravvivono per più di 1/2 settimane e che i maschi vivono per circa una settimana e si nutrono esclusivamente di nettare e altre fonti di zucchero. Si nota che le differenze nell'assunzione di cibo dei genitori possono influenzare la sopravvivenza della progenie delle zanzare17. Nel nostro esperimento, le femmine adulte e i maschi nel sangue (femmina 24,5 x 6,8; maschio 18,5 - 6,9) e r-liq_diet (femmina: 22,5 - 8,1; maschio: 11,9 x 6,9) gruppi avevano una media di aspettative di vita simile (Tabella 3) e le femmine hanno mostrato un aumento della durata di vita rispetto ai maschi.
Dimensione del corpo F1
Lunghezza dell'ala è stato utilizzato come indicatore della dimensione del corpo adulto. Rispetto ad altre specie, gli adulti Anopheles sono zanzare di piccole e medie dimensioni con una lunghezza dell'ala compresa tra 2,8 e 4,4 mm di lunghezza dell'ala18. La dimensione corporea adulta delle zanzare F1 Anopheles alimentate al r-liq_diet era compresa nell'intervallo previsto ed era simile alle zanzare insettiche alimentate nel sangue (Figura 10).
Analisi statistica
I dati presentati rappresentano la media di almeno tre esperimenti indipendenti (se non diversamente specificato). Le barre di errore rappresentano il SEM. Quando i dati seguirono una distribuzione gaussiana, gruppi indipendenti furono confrontati usando il test di t di Student, altrimenti fu applicato il test Mann-Whitney. Le differenze tra i gruppi artificiali alimentati a dieta sono state analizzate utilizzando il test esatto del Fisher e sono state considerate significative a P 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> Figura 1: raccolta di sangue di topo CD1 per puntura intracardiaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> Figura 2: Apparato di alimentazione artificiale standard. L'alimentatore di vetro contiene r-liq_diet che viene alimentato alle zanzare femminili di Anopheles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> Figura 3: Anopheles zanzare dopo l'alimentazione artificiale. Da sinistra a destra: una femmina completamente innata a cui è stato offerto r-liq_diet, femmina non ingerita a cui è stato offerto r-liq_diet, maschio e femmina completamente incisa a cui è stato offerto sangue di topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> Figura 4: Uova di anopheles deposte 48 h dopo l'alimentazione delle femmine con il r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> Figura 5: Stadi larve L2 che si sono sviluppate dalle uova e sono state raccolte su carta da filtro e collocate in vassoi contenenti acqua distillata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> Figura 6: Ala destra da una generazione di F1 di una zanzara femmina Anopheles coluzzii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> Figura 7: Protocollo schematico del test della dieta artificiale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> Figura 8: Tassi di alimentazione delle zanzare femminili alimentate sia nelle diete artificiali che nel sangue. Gli asterischi indicano differenze significative tra le zanzare alimentate con le diete r-liquid e i-liquid e il gruppo di controllo alimentato dal sangue. Il test esatto di Fisher a due lati: 95% fiducioso Livello [CL]: 0.3776 a 0.6194) per la dieta r-liquid rispetto al sangue,: P - 0.0335 (rischio relativo: 1.379, 95% CL: 1.044 a 1.836) per il sangue contro i-liquid dieta. Blu: non nutrito; rosso: nutrito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> Figura 9: Effetto del pasto senza sangue formulato sulla mortalità e sul rapporto maschio/femmina delle zanzare F1 Anopheles coluzzii. Sono stati effettuati tre esperimenti indipendenti, ognuno con 30 zanzare per dieta. Un test t non accoppiato non ha mostrato differenze significative tra il gruppo di alimentazione del sangue e il gruppo di alimentazione r-liq_diet (i valoridi P variavano da 0,5047 a 0,8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> Figura 10: Lunghezza dell'ala. Per determinare la lunghezza dell'ala è stata utilizzata la distanza dall'incisione assiale alla vena R4-5, esclusa la frangia seta. La taglia è stata valutata per 5 femmine e 5 maschi per ogni gruppo dietetico (media - SEM). I valori sono rappresentati come la media : SEM. Salmone: r-liq_diet; rosso: sangue vertebrato. Test t non accoppiato; ala sinistra femminile: t - 1.300, df - 8, P - 0,2298; l'ala sinistra maschile: t - 2,400, df - 8, P - 0,0432; ala destra femminile: t - 1.300, df - 8, P - 0,2298; ala destra maschile: t - 2.277, df - 7, P - 0,0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componenti</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Tripfosfato adenosina</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumin a siero bovino</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colesterolo</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anidrode cloruro di calcio</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di colina</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pantotonina di Calcio D (vitamina B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anidro di D-glucosio</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato ferrico non disidratato</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido folico</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicina</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-inositolo</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-arginina monoidrocloruro</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-cistina diidrocloruro</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-istidino monoidrocloruro monoidrato monoidrato</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-isoleucina</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-leucina</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-lisina monoidrocloruro</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-troionina</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-fenilalanina</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-serina</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-threonina</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tirosina disidratazione sale dissodio</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-valina</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anidro di solfato di magnesio</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niacinamide (nicotinamide)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenolo rosso</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di potassio</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monoidrocloruro piridoxine</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sale di sodio acido piruvic</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riboflavina (vitamina B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bicarbonato di sodio</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di sodio</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anidro monobasico di fosfato di sodio</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamina amonoidrocloruro (vitamina B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solo in r-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: La composizione della dieta i-liquida e della dieta r-liquid.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Numero totale di uova (SEM)</td>
			<td>Uova/femmina (SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sangue</td>
			<td>733 : 330</td>
			<td>24 x 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 x 164</td>
			<td>25 x 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Lotti di uova prodotti da Anopheles coluzzii femmine. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti per ogni dieta sperimentale utilizzando 30 zanzare femmine in ciascuna.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Femmine (giorni : SEM)</td>
			<td>Maschi (giorni : SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sangue</td>
			<td>24,5 x 6,8</td>
			<td>18,5 x 6,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22,5 x 8,1</td>
			<td>11,9 x 6,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Aspettativa di vita delle zanzare F1 Anopheles. La longevità delle zanzare F1 provenienti da F0 alimentati artificialmente è stata valutata registrando le date di nascita e morte di ogni zanzara proveniente dallo stesso gruppo dietetico (sono state seguite 15 femmine e 15 maschi). I risultati sono rappresentati come la durata media della vita delle zanzare per gruppo di dieta.

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A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Viene presentato un protocollo per la formulazione di una dieta artificiale priva di sangue per nutrire le zanzare Anopheles in cattività. Questa dieta ha una prestazione simile al sangue vertebrato e innesca l'oogenesi e la maturazione delle uova e produce progenie adulto praticabile.

Una dieta senza sangue per allevare zanzare anofeline

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Parassiti della malaria come incontrati dalle zanzare che svolgono un ruolo importante nella diffusione della malattia. Finora, è stato impossibile allevare zanzare antimalarica senza sangue. E per superare questa limitazione, il nostro protocollo descrive una dieta sostitutiva del sangue che è in grado di supportare l'allevamento di zanzare nell'insettoriale.L'uso di una dieta priva di sangue è altamente vantaggioso rispetto al sangue. Una dieta priva di sangue non ha i vincoli etici come l'uso di sangue umano o animali da esperimento. Sostituire gli animali nella sperimentazione fa parte della nostra politica delle tre R.Sostituire, ridurre, perfezionare. Il non utilizzo di sangue riduce i costi e la logistica associata alla raccolta, conservazione e manutenzione del sangue rosso. L'uso di diete artificiali può facilitare il test di molecole anti plasmodio.Fino ad ora, abbiamo testato le nostre diete utilizzando diverse specie di anopheles. In tutti loro, la dieta era ben ingoiata dalle femmine e consentiva la produzione e la deposizione delle uova. Crediamo che questa dieta abbia un potenziale uso per l'allevamento di altre specie di zanzare.In realtà, ora lo stiamo testando per le aedes, un vettore di molte malattie come la febbre dengue, il virus Zika o la febbre gialla. Mantenere le zanzare a ceppo di anopheles coluzzii yaonde in una stanza a 26 gradi Celsius, umidità del 75% e sotto un ciclo buio chiaro da 12 ore a 12 ore. Ospita le zanzare usando condizioni insettoriali standard in un'unica gabbia per garantire l'accoppiamento.Usa una pipetta di plastica per raccogliere pupe di zanzara in un piccolo contenitore d'acqua. Posizionare il contenitore all'interno di una gabbia per zanzare per far emergere e accoppiare le zanzare adulte. Fornire una soluzione di alimentazione del glucosio al 10% nella gabbia.Tre giorni dopo l'emergenza, usa un aspiratore per raccogliere il numero necessario di femmine dalla gabbia di scorta in un foglio di carta. Per distinguere, le femmine sono più grandi e i maschi hanno una proboscide più ampia e piumata. Un giorno prima di nutrire le tracce, rimuovere la soluzione di alimentazione del glucosio al 10%.Il giorno successivo, preparare diete liquide artificiali in condizioni sterili nell'armadio a flusso laminare secondo il manoscritto. Aggiungere tutti gli ingredienti a un tubo di plastica. Mescolare accuratamente tutti gli ingredienti e filtrare utilizzando un microfiltro da 0,45 micron.Riempire una siringa sterile da 1 millilitro dotata di un ago da mezzo pollice calibro 27 con 100 microlitri di un milligrammo per millilitro eparina. Quindi, anestetizza da sei a otto settimane CD un topo femmina con chetamina e xiazina usando la via intra peritoneale. Valutare se il mouse mostra una reazione muscolare e una risposta a diversi stimoli fisici.Eseguire la puntura cardiaca. Quindi raccogliere il sangue dal topo in un micro tubo e mantenere il sangue a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Successivamente, raccogli circa 30 zanzare femminili dalla gabbia di stoccaggio usando un aspiratore.Trasferisci le zanzare femminili in tazze di carta da 500 millilitri e copri con una sottile rete di zanzariere in modo che non possano fuggire. Allungare la membrana del parafilm attraverso la bocca dell'alimentatore di vetro per contenere il pasto. Applicare un apparecchio di alimentazione artificiale a campana di vetro collegato a tubi di plastica sulla parte superiore di ogni tazza.Fornire un flusso d'acqua costante ai tubi cilindrici e all'alimentatore in modo che la temperatura all'interno sia mantenuta a circa 37,5 gradi Celsius. Applicare un millilitro di dieta liquida prebellita a 37 gradi Celsius o sangue di topo fresco in un alimentatore di vetro. Nutrire le zanzare per 60 minuti al buio in 26 gradi Celsius.Dopo l'alimentazione artificiale, anestetizza freddamente le zanzare a 20 gradi Celsius per 30 secondi. Quindi, metti le zanzare in una piastra di Petri refrigerata. Registra il numero di zanzare femminili completamente ingoiati.Separa 30 femmine completamente ingoiate e mettile su una nuova gabbia. Ora, posizionare una carta filtrante umidificata nella parte inferiore di ogni gabbia. Mantenere le zanzare a 26 gradi Celsius, 75% di umidità e sotto un ciclo buio chiaro da 12 ore a 12 ore con 10% glucosio ad libitum.A 96 ore e 120 ore dopo l'alimentazione, contare le uova con l'aiuto di una lente d'ingrandimento portatile. Inondare la carta filtrante con acqua distillata per raccogliere le uova in vassoi pieni di acqua distillata. Nutrire le larve ogni giorno con circa 13 milligrammi di cibo macinato per vassoio.Rimuovere le pupe morte e le larve con una pipetta di plastica ogni giorno. Quando tutte le pupe si sono sviluppate in adulti, conta il numero di maschi e femmine adulti, registra le date di schiusa e morte e calcola i tassi di mortalità. Per testare la longevità, raccogli 15 maschi adulti e 15 femmine adulte della generazione F1 di ogni gruppo dietetico in un foglio di carta.Nutrire gli adulti con soluzione di glucosio al 10% ad libitum. Usa una pinzetta o un pennello per rimuovere quotidianamente gli adulti morti. Mantenere le zanzare alla stessa temperatura, umidità, condizioni del ciclo leggero e regime di alimentazione dello zucchero.Registrare le date di morte e calcolare la longevità. Per misurare la lunghezza delle ali, anestetizza freddamente le zanzare adulte di F1 di cinque giorni maschili e femmine di ogni gruppo dietetico a 20 gradi Celsius per 90 secondi. Sotto uno stereoscopio, afferrare delicatamente il torace di ogni zanzara con le forcep e posizionarle lato ventrale verso l'alto.Raccogli entrambe le ali usando un bisturi e posizionale su uno scivolo al microscopio pulito contenente una goccia essiccata di mezzo di montaggio per ulteriori misurazioni utilizzando un oculare graduato. Misurare la lunghezza dell'ala con uno stereoscopio utilizzando un micrometro. In questo studio, le prestazioni delle zanzare anopheles femminili nutrite con il ricco pasto artificiale formulato e le zanzare alimentate con la dieta liquida iniziale, o un pasto di sangue fresco è stato confrontato.Il numero di zanzare femminili ingoiate alimentate con ricchi pasti artificiali all'89% era significativamente superiore al numero di femmine ingoiate nutrite di sangue al 56%La generazione di zanzare F1 alimentate con il sangue o il ricco pasto artificiale aveva tassi di mortalità e sopravvivenza comparabili. La variabilità era più alta nel sangue alimentato zanzare rispetto alle zanzare nutrite con il ricco pasto artificiale. In termini di dimensioni corporee adulte, le zanzare anopheles F1 alimentate con ricco pasto artificiale erano entro l'intervallo previsto ed erano simili alle zanzare insettoriali alimentate a sangue.A mio parere, è molto importante assemblare correttamente gli alimentatori con il parafilm per evitare la sua rottura. Se la membrana non è ben attaccata all'alimentatore di vetro, puoi perdere il pasto e probabilmente perdere alcune delle zanzare in quanto possono essere coperte dal pasto e morire. Vorremmo eseguire un saggio di attrazione a doppia scelta, ad esempio usando un olfattometro in modo da poter effettivamente valutare se le nostre femmine sono più attratte dalla dieta artificiale o dal sangue.Inoltre, ora stiamo liofilizzando la dieta artificiale e studiando la sua stabilità tra temperature diverse da molto tempo. Oltre agli ovvi miglioramenti alla stabilità e allo stoccaggio su cui abbiamo lavorato, l'uso a lungo termine della dieta sulla forma fisica e la fisiologia delle zanzare dovrebbe essere studiato. Credo che produrre gli anopheles senza sangue faciliterà immensamente la ricerca vettoriale e l'implementazione di strumenti di controllo che dipendono da un gran numero di zanzare.

Research

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Biology

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