Name: a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) for teknisk støtte, Joana Gomes og Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) for å opprettholde Anopheles myggkolonier. Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04313/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Mus ble hentet fra IHMT dyrehus. Dyreforsøk ble utført i henhold til portugisisk lov og retningslinjer for bruk av laboratoriedyr. Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal godkjente alle studieprotokollene (id-godkjenninger: 023351 og 023355).
MERK: Utfør alle fôringsanalyser ved ~26 °C.
1. Mygg
<ol><li>Vedlikehold Anopheles coluzzii (tidligere Anopheles gambiae M form) Yaoundé belastning mygg ved 26 ° C, 75% fuktighet under en 12 h:12 h lys: mørk syklus. Husmygg ved hjelp av standard insektsforhold for å garantere parring.</li>
	<li>Samle myggpupper i en liten vannbeholder. Plasser beholderen inne i et myggbur for å la voksne mygg dukke opp og mate. Sørg for 10 % glukosefôringsoppløsning. Tre dager etter fremveksten samle det nødvendige antall mygg fra lagerburet ved hjelp av en aspirator.</li>
	<li>En dag før fôringsforsøkene fjerner du 10 % glukosefôringsoppløsning. MERK: 3 dag gamle mygg ble brukt gjennom eksperimenter.</li>
</ol>2. Myggfôring
<ol><li>Fremstilling av kunstige flytende dietter<ol>
<li>Forbered de kunstige flytende dietter under sterile forhold i et lamimer strømningsskap. Forbered det rike flytende kostholdet (r-liq_diet) ved å legge til følgende til det første flytende kostholdet (i-liq_diet; Dulbeccos modifiserte Eagle medium [høy glukose med L-glutamin], se tabell 1): 0,55 g /L ATP, 1 g / L kolesterol, og 200 g / L storfe serum albumin (BSA). Bland alle ingrediensene grundig og filtrer med et mikrofilter på 0,45 μm. MERK: Ikke oppbevar diettene; forberede dietter fersk fra lagerløsninger for hvert eksperiment som de mister kvalitet når de lagres. Komponenter i dietter er beskrevet i tabell 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mus blod samling<ol>
<li>Bedøve 6-8 uker gamle CD1 kvinnelige mus (Musorkuus) med ketamin (120 mg/kg) og xylazine (16 mg/kg) ved hjelp av intraperitoneal rute.</li>
		<li>Utfør hjertepunktering (figur 1) når musen ikke viser muskelreaksjon som svar på forskjellige fysiske stimuli (f.eks. tå og haleklyper).</li>
		<li>Samle blod med en steril 1 ml sprøyte med en 27 G x 1/25 (0,4 x 12 mm2)nål som inneholder 100 μL 1 mg/ml heparin (natriumsalt) for å forhindre dannelse av blodpropper. Oppretthold blod ved 37 °C ved hjelp av et vannbad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kunstig fôring<ol>
<li>Samle ca 30 kvinnelige mygg fra lagerburet ved hjelp av en aspirator.</li>
		<li>Overfør de kvinnelige myggene til 500 ml papirkopper og dekk med et fint myggnettnett, slik at de ikke kan unnslippe. Påfør en glassmater koblet til plastrør for å opprettholde en konstant vannstrøm til toppen av hver kopp (figur 2). Gi en konstant vannstrøm til sylindriskrør og mater slik at temperaturen innenfor holdes på ca. 37,5 °C. MERK: Et standard kunstig fôringsapparat forglassklokke 16 ble brukt til å levere de formulerte diettene til kvinnelige mygg.</li>
		<li>Strekk parafinfilmmembran over munningen av glassmateren for å inneholde måltidet.</li>
		<li>Varm i-liq_diet og r-liq_diet ved bruk av vannbad. Påfør 1 ml i glassmateren. Mate myggene i 60 min i mørket med enten i-liq_diet, r-liq_diet eller frisk museblod. Utfør analyser ved 26 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluering av fôringshastigheten.<ol>
<li>Etter kunstig fôring, kald-bedøve myggene ved -20 ° C i 30 s. Plasser myggene i en nedkjølt Petri-tallerken.</li>
		<li>Ta opp antall fullt oppslukt (figur 3) kvinnelige mygg. MERK: Prosentandelen av matet mygg brukes som proxy for fôring suksess.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Livshistoriske egenskaper
<ol><li>Eggproduksjon og fertilitet<ol>
<li>Overfør de fullt oppslukte hunnene, bruk en børste, til individuelle bur (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Hold myggene ved 26 ± 1 °C, 75 % fuktighet og 12 t:12 t lys:mørk syklus med 10 % glukosealibitum.</li>
		<li>Førtiåtte timer etter fôring, legg til et fuktet filterpapir nederst for egglegging (Figur 4). Tell eggene ved 48 timer og 72 timer etter tilsetning av eggleggepapiret ved hjelp av et håndholdt forstørrelsesglass. Overfør filterpapiret med destillert vann for å samle eggene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larver dødelighet<ol>
<li>Samle eggene i skuffer (23 cm x 15 cm x 6 cm) fylt med destillert vann (figur 5). Oppretthold vannstanden i skuffene konstant under forsøkene.</li>
		<li>Mate larver daglig med ca 13 mg malt fiskemat per brett. Påfør et lignende fôringsregime på alle replikeringsskuffene.</li>
		<li>Fjern døde pupper og larver daglig. Fullfør forsøkene når alle pupper har utviklet seg til voksne og telle antall voksne menn og kvinner.</li>
		<li>Registrer datoene for klekking og død og beregn dødeligheten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lang levetid<ol>
<li>Samle 15 voksne menn og 15 voksne kvinner fra F1 generasjon av hver diett gruppe. Hold menn og kvinner i samme bur.</li>
		<li>Mate voksne med en 10% glukoseløsning annonse libitum. Fjern de døde voksne daglig.</li>
		<li>Oppretthold myggene ved samme temperatur, fuktighet, lyssyklusforhold og sukkerfôringsregime som beskrevet ovenfor.</li>
		<li>Registrer dødsdatoene og beregn levetiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Måling av vingelengde<ol>
<li>Kaldbedøve fem dager gamle F1 voksne mygg (mann og kvinne) fra hver diettgruppe ved -20 °C i 90 s.</li>
		<li>Under et stereoskoper, ta forsiktig tak i thoraxen til hver mygg med tang og plasser dem ventralside opp.</li>
		<li>Samle begge vingene ved hjelp av en skalpell og legg dem på et rent mikroskoplysbilde som inneholder en tørket dråpe monteringsmedium. Ved hjelp av en 20 G nål legge ekstra monteringsmedium til grensene av coverslip og sakte senke dekseletslip på vingene.</li>
		<li>Mål vingelengden (figur 6) med et stereoskopet ved hjelp av et mikrometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2016).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).</li><li>Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+technologies+to+induce+sterility.">Transgenic technologies to induce sterility.</a> Malaria Journal. 8, 7 (2009).</li><li>Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+applications+of+induced+sterilisation+in+field+populations+of+mosquitoes.">Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes.</a> Malaria Journal. 8, 2 (2009).</li><li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+Field+Release+of+Genetically+Engineered+Sterile+Male+Aedes+aegypti+in+Malaysia.">Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia.</a> PLoS One. 7, 42771 (2012).</li><li>Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Preliminary+Note+on+Egg+Production+from+Milk-Fed+Mosquitoes.">A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes.</a> The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).</li><li>Kogan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).</li><li>Griffith, J. S., Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+with+a+blood+substitute+diet+for+the+females.">Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females.</a> Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).</li><li>Jason Pitts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-free+protein+meal+supporting+oogenesis+in+the+Asian+tiger+mosquito,+Aedes+albopictus+(Skuse).">A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse).</a> Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).</li><li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+serum+and+BSA,+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti.">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938 (2015).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Diets+for+Mosquitoes.">Artificial Diets for Mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267 (2016).</li><li>Cosgrove, J. B., Wood, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+variations+in+a+formulated+protein+meal+on+the+fecundity+and+fertility+of+female+mosquitoes.">Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes.</a> Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -. H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signalling+during+mosquito+reproduction.">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction.</a> Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , (1992).</li><li>Talyuli, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+chemically+defined+artificial+diet+as+a+tool+to+study+Aedes+aegypti+physiology.">The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology.</a> Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).</li><li>Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii:+The+effect+of+second+blood+meal+and+anti-sporozoite+antibodies+on+development+and+gene+expression+in+the+mosquito+vector,+Anopheles+stephensi.">Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi.</a> Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).</li><li>Phasomkusolsil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mosquito+vectors:+effects+of+blood+source+on+feeding,+survival,+fecundity,+and+egg+hatching+rates.">Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates.</a> Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).</li><li>Gillies, M. T., De Meillon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anophelinae+of+Africa+South+of+the+Sahara+(Ethiopian+zoogeographical+region).">The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region).</a> Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).</li><li>Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+in+insects.">Fat metabolism in insects.</a> Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).</li><li>Clifton, M. E., Noriega, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+follicles+after+a+blood+meal+is+dependent+on+previtellogenic+nutrition+and+juvenile+hormone+in+Aedes+aegypti.">The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+SkitoSnack,+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota.">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8, 11023 (2018).</li><li>Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+nitric+oxide+and+transforming+growth+factor-beta1+in+malaria.">Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria.</a> Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).</li><li>Sumba, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oviposition+patterns+of+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+Giles+(Diptera:+Culicidae)+on+different+types+of+aqueous+substrates.">Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates.</a> Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Suksessen til vårt formulerte blodfrie kosthold er sannsynligvis et resultat av den synergistiske fysiologiske effekten av alle komponentene som legges til i-liq_diet (rik på sukker, aminosyrer, vitaminer og mikroelementer): BSA (proteinkilde), ATP (phagostimulant) og kolesterol (lipidkilde). Tilskudd av r-liq_diet med de enkelte komponentene alene var ikke effektiv i å stimulere eggproduksjon (data ikke vist). En ulempe med protokollen kan være kostnaden for noen av komponentene, for eksempel kolesterol. Likevel er dens tilstedeværelse grunnleggende, da insekter ikke er i stand til å syntetisere det19, og dette molekylet er forløperen til ecdysteroidhormonene som regulerer eggeplommesyntese og eggmodning hos leddyr20. Lavere mengder kolesterol bør testes for å optimalisere mengden som trengs med sikte på å redusere kostnadene og øke fordelene med det kunstige kostholdet.
En annen begrensning av metoden er at det kunstige kostholdet må tilberedes på lagerløsninger, da det en gang er utarbeidet i sin endelige væskeform, mister kvaliteten etter lagring. I fremtiden kan vårt formulerte kosthold tilberedes som en tørket kraft, lik SkitoSnackt, en kunstig blodmåltiderstatning for Aedes aegypti mygg21.
Ved siden av å levere de nødvendige næringsstoffene, må et kunstig måltid tiltrekke seg og stimulere kvinnelige mygg til å mate på samme måte som når de spiser på virveldyr friskt blod. Det kunstige blodfrie kostholdet her i beskrevet resulterte i en 20% økning i fullt oppslukte kvinnelige mygg sammenlignet med virveldyr blodmatet gruppe. Dette indirekte målet på attraksjon en ytterligere avklart ved hjelp av olfactometers for å bekrefte at det kunstige kostholdet er mer attraktivt og mer attraktivt for mygg enn friskt blod.
Den høyeste virkningen av dietten på larvaldødelighet ble observert for larver avledet fra mygg matet på blod, noe som tyder på at et kunstig kosthold med stabil sammensetning kan bidra til å redusere dødeligheten og forbedre myggavlssuksess sammenlignet med friskt blod. Det mindre forutsigbare resultatet av et blodmåltid kan oppstå fra vertsvariasjoner i sammensetning17 og tilstedeværelsen i blodet av molekyler som kan forstyrre myggfysiologi22. De foregående fakta understreker fordelene for mygg av høy kvalitet som oppdrar seg av ferskblodfrie dietter.
Totalt var gjennomsnittlig antall egg lagt i vår studie lav i forhold til de som ble rapportert hos noen insektmidler, men gjennomsnittlig antall ovipositerte egg var sammenlignbart med A. gambiae laboratorie-oppdrettet stamme matet på humant blod (22,6 ± 5,5 egg / kvinne)23. Ingen signifikante statistiske forskjeller ble observert mellom våre eksperimentelle grupper matet på enten friskt blod eller på de kunstige måltidene (tabell 2),noe som tyder på at implementeringen av en kunstig membranfôringssystemer med vårt formulerte diett er tilstrekkelig til å opprettholde og forplante Anopheles myggkolonier i fangenskap.
Kunstige blodfrie måltider kan opprettholde Aedes kolonier22,men når de brukes på Anopheles mygg, er de av begrenset eller ingen suksess11. Nylig ble et plasmabasert kunstig måltid for Anopheles mygg beskrevet24, men fôringshastigheter og reproduktive potensial var lavt. Våre resultater representerer et betydelig fremskritt i toppmoderne (anmeldt av Gonzales og Hansen11)da våre formulerte r-liq_diet hadde en lignende eller bedre ytelse enn standard virveldyr blodmåltid. Ytterligere forbedringer på lagringsstabilitet og kostnader bør utvide omfanget av søknaden.

Vektorbårne sykdommer påvirker flere millioner mennesker over hele verden og forårsaker millioner av dødsfall hvert år. De overføres av insekter smittet med sykdomsproduserende mikroorganismer (protozoan, virus) som er anskaffet når de spiser blod fra en smittet vert. Deretter vil den infiserte vektoren overføre patogenet til en ny vert under neste blodmåltid. Malaria er den dødeligste vektorbårne sykdommen som overføres av flere forskjellige arter av Anopheles mygg og påvirker 40% av verdens befolkning1. Malariaprotistparasitten er ansvarlig for mer enn 400.000 dødsfall hvert år, hvorav de fleste er barn under 5 år (Verdens helseorganisasjon). Den kvinnelige Anopheles mygg overfører malaria parasitten av Plasmodium slekten mellom mennesker og andre dyr når den feeds på virveldyr blod, et nødvendig skritt for egg produksjon og utvikling2.
Nåværende strategier for utryddelse av malaria og andre fremvoksende dødelige myggvektorbårne sykdommer er avhengige av utviklingen av innovative myggkontrollstrategier3,4,5, som inkluderer utgivelsen i naturen av et stort antall mygg avlet i insektære. En avgjørende begrensende faktor er imidlertid avhengigheten av tilførsel av friskt blod for effektiv myggoppdrett og avl. Den variable sammensetningen av virveldyr blod kan negativt påvirke myggfruktbarhet og avkom fitness og kan begrense påliteligheten og bærekraften til fangede avlskolonier. Myggfrigjørings- og kontrollprogrammer krever store myggproduksjonssystemer og en regelmessig tilførsel av store mengder virveldyr blod. Dette er et stort hinder for myggproduksjon og reiser en rekke etiske problemstillinger knyttet til bruk av levende dyr og logistiske begrensninger forårsaket av de tilhørende krevende sikkerhetsforskriftene. Dette gjør kostnadene ved vedlikehold og sikkerhet av myggkolonier høye og utfordrer bærekraften til dagens myggoppdragspraksis, spesielt i lavinntektsland der trusselen om malaria er langt større.
Nylig forskning har vært fokusert på utviklingen av blod substitutter som etterligner en virveldyr blod måltid, men så langt, bare begrenset suksess har blitt oppnådd6,7,8,9. En vellykket kunstig diett må (1) provosere full kvinnelig myggengorgement, (2) utløser vitellogenin produksjon, (3) produsere store grupper av levedyktige egg, og (4) generere hedningavkomgen10. I tillegg har kunstige dietter en standard sammensetning og er dermed mer pålitelig for produksjon av mygg for forskning og kontrollformål. Vellykkede blodfrie dietter er utviklet for Aedes mygg (anmeldt av Gonzales og Hansen11), men ikke for Anopheles spp. Eksisterende kunstige dietter inneholder et fagossentralstimulerende middel (f.eks. ATP10), en proteinkilde for eggmodning6,12, karbohydrater som energikilde og aminosyrer (aa)13 som er grunnleggende for eggproduksjon og er en viktig begrensende faktor for myggfruktbarhet14. En kunstig blodfri diett må også gi kolesterol15, noe som forbedrer eggproduksjonen. Her beskriver vi et kunstig blodfritt kosthold for kvinnelige Anopheles mygg og viser at det har en konsekvent og tilsvarende ytelse til et høykvalitets virveldyr blodmåltid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A790G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>199342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (high glucose with L-glutamine)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan mounting medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1079610100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassfeeder</td>
			<td>Local glazier</td>
			<td>by design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Pan Reac AppliChem</td>
			<td>A3004,0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td>Merial, Portugal</td>
			<td>01MER122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G x 1&#34; 0.9 x 25 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer, Portugal</td>
			<td>7427831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Millex-HV 0,45</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR25KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1ml, 27 G x &#189;&#34; 0.4 x 12 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>BS-NIN2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teich Mix Astra Pond</td>
			<td>Astra</td>
			<td>4030733100957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Flakes</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4004218742642</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes

Malariaforskning krever store avls- og produksjonsforhold for mygg (Anopheles spp.) i fangenskap. Den bærekraftige og pålitelige produksjonen av mygg er for tiden hemmet av tilførselav ferskvirveldyr blod. Alternativer til blod er nødvendig for å fremme effektive kontrollstrategier for malaria og andre vektorbårne sykdommer som overføres av blodfôring insekter. Med dette i tankene ble kunstige flytende dietter formulert som erstatninger for friskvirveldyrblod. Her rapporterer vi et blodfritt kunstig flytende kosthold som leverer fôringshastigheter som ligner på blod og etterligner de fysiologiske effektene av et friskt virveldyr blodmåltid. Kostholdet induserer ovarie- og eggmodning av Anopheles mygg og gir også god larval overlevelse og utvikling av funksjonelle voksne. Det formulerte blodfrie flytende dietten er et viktig fremskritt mot bærekraftig myggavl i fangenskap og vil redusere vedlikeholdskostnadene til myggkolonier og eliminere behovet for friskt virveldyrblod.

Resultatene som er beskrevet nedenfor, sammenligner ytelsen til kvinnelige Anopheles mygg matet med det formulerte rike kunstige måltidet (r-liq_diet) og mygg matet på det første flytende kostholdet (i-liq_diet) eller et ferskt blodmåltid. Kostholdet ble testet etter skjematisk protokoll avbildet i figur 7. R-liq_diet beskrevet herer er en del av et patent (PCT/IB2019/052967).
Andel fullt oppslukte kvinner
Antall engorged kvinnelige mygg matet med r-liq_diet (89%) var signifikant høyere enn antall engorged kvinner matet på blod (56%) (Figur 8).
Fecundity og fruktbarhet
Kvinnelig fecundity og fruktbarhet for den første gonotrofiske syklusen ble brukt til å evaluere næringskvaliteten til i-liq_diet og r-liq_diet. I gjennomsnitt ble 24 ± 11 egg lagt av kvinner matet på ferskvirveldyrblod, mens kvinner matet på r-liq_diet la i gjennomsnitt 25 ± 5 egg (Tabell 2). Ingen egglegging ble observert av kvinner matet på i-liq_diet.
F1 dødelighet
Formen på F1 mygg ble evaluert mellom kolonier matet på virveldyr blod eller r-liq_diet. Larver, pupper og voksendødelighet ble registrert. Variabilitet (standardfeil i gjennomsnittet [SEM]) var høyere i blodfôret mygg (figur 9 og tabell 2) i forhold til mygg matet r-liq_diet. F1-generasjonen mygg matet på enten blodet eller r-liq_diet hadde sammenlignbar dødelighet og overlevelse.
Forventet levealder for F1
Det er anslått av Center for Disease Control and Prevention at ville voksne kvinnelige mygg lever i opptil en måned, men overlever sannsynligvis ikke i mer enn 1-2 uker, og at menn lever i omtrent en uke og spiser utelukkende på nektar og andre sukkerkilder. Det bemerkes at forskjeller i foreldrematinntak kan påvirke overlevelsen av myggavkomgen17. I vårt eksperiment hadde voksne kvinner og menn i blodet (kvinner 24,5 ± 6,8; menn 18,5 ± 6,9) og r-liq_diet (kvinne: 22,5 ± 8,1; menn: 11,9 ± 6,9) grupper hadde tilsvarende gjennomsnittlig levealder gjennomsnitt (Tabell 3) og kvinner viste økt levetid i forhold til menn.
F1 kroppsstørrelse
Vingelengde ble brukt som en indikator på voksen kroppsstørrelse. Sammenlignet med andre arter er Anopheles voksne små og mellomstore mygg med en vingelengde på mellom 2,8 og 4,4 mm vingelengde18. Voksen kroppsstørrelse på F1 Anopheles mygg matet r-liq_diet var innenfor forventet rekkevidde og var lik blodmatet insektmygg (Figur 10).
Statistisk analyse
Dataene som presenteres representerer gjennomsnittet for minst tre uavhengige eksperimenter (med mindre annet er oppgitt). Feillinjer representerer SEM. Da data fulgte en gaussisk distribusjon, ble uavhengige grupper sammenlignet med studentens t-test, ellers ble Mann-Whitney-testen brukt. Forskjeller mellom de kunstige diett-matet gruppene ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test og ble ansett å være signifikant ei p ≤ 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> Figur 1: CD1 mus blod samling ved intracardiac punktering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> Figur 2: Standard kunstig fôringsapparat. Glassmateren inneholder r-liq_diet som blir matet til kvinnelige Anopheles mygg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> Figur 3: Anopheles mygg etter kunstig fôring. Fra venstre til høyre: en fullt oppslukt kvinne som ble tilbudt r-liq_diet, ikke-engorged kvinne som ble tilbudt r-liq_diet, mann, og fullt oppslukt kvinne som ble tilbudt musblod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> Figur 4: Anopheles egg lagt 48 h etterfôring av kvinner med r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> Figur 5: L2 larver stadier som utviklet seg fra eggene og ble samlet på filterpapir og plassert i skuffer som inneholder destillert vann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> Figur 6: Høyrevinge fra en F1-generasjon av en Anopheles coluzzii kvinnelig mygg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> Figur 7: Skjematisk protokoll for kunstig dietttesting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> Figur 8: Fôringsfrekvensen til de kvinnelige myggene matet enten kunstige dietter eller blod. Stjerner indikerer betydelige forskjeller mellom myggene matet r-flytende og i-flytende dietter og blodmatet kontrollgruppe. Tosidig Fishers eksakte test: ****P ≤ 0,0001 (relativ risiko: 0,4828, 95% selvsikkert nivå [CL]: 0,3776 til 0,6194) for r-flytende diett versus blod, *P = 0,0335 (relativ risiko: 1,379, 95% CL: 1,044 til 1,836) for blod versus i-flytende diett. Blå: umatet; rød: matet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> Figur 9: Effekten av det formulerte blodfrie måltidet på dødeligheten og forholdet mellom menn og kvinner i F1 Anopheles coluzzii mygg. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, hver ved hjelp av 30 mygg per diett. En ikke-paret t-test viste ingen signifikante forskjeller mellom blod-matet gruppen og r-liq_diet matet gruppe (P verdier varierte fra 0,5047 til 0,8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> Figur 10: Vingelengde. Avstanden fra aksial snitt til R4+5 vene unntatt frynsesettet ble brukt til å bestemme vingelengden. Størrelsen ble evaluert for 5 kvinner og 5 menn fra hver diettgruppe (gjennomsnitt ± SEM). Verdiene er representert som gjennomsnittet ± SEM. Laks: r-liq_diet; rødt: virveldyr blod. Ikke paret t-test; kvinnelig venstre vinge: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; mann venstre vinge: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; kvinnelig høyre ving: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; høyre ving: t = 2.277, df = 7, P = 0,0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponenter</td>
			<td>g/l</td>
		</tr>
<tr>
<td>* Adenosin Trifosfat</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>* Bovine Serum Albumin</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>* Kolesterol</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalsiumklorid vannfri</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kolinklorid</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-kalsium pantothenate (vitamin B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glukose vannfri</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ferric nitrat nonahydrat</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Folsyre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glysin</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-inositol</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-arginin monohydroklorid</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-cystindihydroklorid</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-histidin monohydroklorid monohydrat</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-isolelecine</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-leuccine (andre)</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-lysin monhydroklorid</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-metionin</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-fenylalanin</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-serine (andre)</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-threonine</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tryptofan</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tyrosin disodium salt dihydrat</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-valine (andre)</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesiumsulfat vannfri</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niacinamid (nikotinamid)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenol rød</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kaliumklorid</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyridoksin Monohydroklorid</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyruvic syre natriumsalt</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riboflavin (vitamin B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumbikarbonat</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumklorid</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfat monogrunnleggende vannfri</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamin amonohydrochlorid (vitamin B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*Bare i r-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammensetningen av i-flytende diett og r-flytende diett.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Totalt eggnummer (± SEM)</td>
			<td>Egg/kvinne (± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blod</td>
			<td>733 ± 330</td>
			<td>24 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 ± 164</td>
			<td>25 ± 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Eggpartier produsert av Anopheles coluzzii-kvinner. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver eksperimentell diett ved hjelp av 30 kvinnelige mygg i hver.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Kvinner (dager ± SEM)</td>
			<td>Menn (dager ± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blod</td>
			<td>24,5 ± 6,8</td>
			<td>18,5 ± 6,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22,5 ± 8,1</td>
			<td>11,9 ± 6,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Forventet levetid for F1 Anopheles mygg. Lang levetid på F1 mygg fra kunstig matet F0 ble vurdert ved å registrere fødselsdatoene og døden til hver mygg som kommer fra samme diettgruppe (15 kvinner og 15 menn ble fulgt). Resultatene er representert som gjennomsnittlig mygglevetid per diettgruppe.

Watch this Scientific Journal Video about A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

En protokoll presenteres for formulering av et blodfritt kunstig kosthold for å mate Anopheles mygg i fangenskap. Denne dietten har en lignende ytelse til virveldyr blod og utløser oogenese og egg modning og produserer levedyktig voksen avkom.

Et blodfritt kosthold for å bak anopheline mygg

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Malariaparasitter som møtt av mygg som spiller en viktig rolle på spredningen av sykdommen. Så langt har det vært umulig å oppdra malaria mygg uten blod. Og for å overvinne denne begrensningen beskriver vår protokoll en bloderstatning diett som er i stand til å støtte myggavl i insektet.Bruken av blodfri diett er svært fordelaktig over blod. Et blodfritt kosthold har ikke de etiske begrensningene som bruk av menneskelig blod, eller eksperimentelle dyr. Å erstatte dyr på eksperimentering er en del av vår tre R-politikk.Erstatt, reduser, finjuster. Ikke bruker blod reduserer kostnadene, og logistikken forbundet med innsamling, lagring og vedlikehold av rødt blod. Bruken av kunstige dietter kan lette testing av antiplasmodiummolekyler.Til nå har vi testet våre dietter ved hjelp av forskjellige anopheles arter. I dem alle var dietten godt oppslukt av hunnene og tillot eggproduksjon og legging. Vi tror denne dietten har potensiell bruk for oppdrett av andre myggarter.Faktisk tester vi det nå for aedes, en vektor av mange sykdommer som denguefeber, zikavirus eller gul feber. Opprettholde anopheles coluzzii yaonde belastning mygg i et rom på 26 grader Celsius, 75% fuktighet, og under en 12 time til 12 timers lys mørk syklus. Hus mygg ved hjelp av standard insektforhold i et enkelt bur for å garantere parring.Bruk en plastpipette til å samle myggpuss i en liten vannbeholder. Plasser beholderen inne i et myggbur for å la voksne mygg dukke opp og kompis. Gi 10% glukosefôringsløsning i buret.Tre dager etter fremveksten, bruk en aspirator for å samle det nødvendige antallet kvinner fra aksjeburet til en papirkopp. For å skille, kvinner er større og menn har en bredere og fjærlett proboscis. En dag før fôring stier, fjerne 10% glukose fôring løsning.Neste dag, forberede kunstige flytende dietter under sterile forhold i laminær strømningskabinett i henhold til manuskriptet. Tilsett alle ingrediensene i et plastrør. Bland alle ingrediensene grundig og filtrer med et 0,45 mikrofilter.Fyll en steril 1 milliliter sprøyte utstyrt med en 27 gauge halv tommers nål med 100 mikroliter på ett mg per milliliter heparin. Deretter bedøve seks til åtte uker gamle CD en hunnmus med ketamin og xyazin ved hjelp av intra peritoneal rute. Evaluer om musen viser noen muskelreaksjon og respons på forskjellige fysiske stimuli.Utfør hjertepunkteringen. Samle deretter blod fra musen inn i et mikrorør og opprettholde blod på 37 grader Celsius i et vannbad. Deretter samler du ca 30 kvinnelige mygg fra aksjeburet ved hjelp av en aspirator.Overfør de kvinnelige myggene til 500 milliliter papirkopper og dekk med et fint myggnett slik at de ikke kan unnslippe. Strekk parafilmmembranen over munningen av glassmateren for å inneholde måltidet. Påfør et glass klokke kunstig fôring apparater koblet til plastrør til toppen av hver kopp.Gi en konstant vannstrøm til sylindriske rør og mater slik at temperaturen innenfor holdes på omtrent 37,5 grader Celsius. Påfør en milliliter førkrigsflytende diett ved 37 grader Celsius eller friskt museblod i en glassmater. Mate myggene i 60 minutter i mørket i 26 grader Celsius.Etter kunstig fôring bedøver du myggene ved 20 grader Celsius i 30 sekunder. Deretter legger myggene i en nedkjølt petriskål. Registrer antall fullt engorged kvinnelige mygg.Skill 30 fullt oppslukt kvinner og sette dem på et nytt bur. Plasser nå et fuktet filterpapir nederst i hvert bur. Hold myggene på 26 grader Celsius, 75% fuktighet, og under en 12 time til 12 timers lys mørk syklus med 10% glukose annonse libitum.Ved 96 timer og 120 timer etter fôring teller eggene ved hjelp av et håndholdt forstørrelsesglass. Oversvømme filterpapiret med destillert vann for å samle eggene i skuffer fylt med destillert vann. Mate larvene daglig med ca 13 milligram malt fisk mat per brett.Fjern døde pupper og larver med en plastpipette daglig. Når alle pupper har utviklet seg til voksne, telle antall voksne menn og kvinner, registrere datoene for klekking og død, og beregne dødeligheten. For å teste for lang levetid, samle 15 voksne menn og 15 voksne kvinner fra F1-generasjonen av hver diettgruppe til en papirkopp.Mate voksne med 10% glukose løsning ad libitum. Bruk pinsett eller en børste for å fjerne de døde voksne daglig. Opprettholde myggene ved samme temperatur, fuktighet, lyssyklusforhold og sukkerfôringsregime.Registrer dødsdatoene og beregn levetiden. For å måle vingelengde, bedøver du fem dagers gamle F1 mannlige og kvinnelige voksne mygg fra hver diettgruppe ved 20 grader Celsius i 90 sekunder. Under et stereoskop, ta forsiktig tak i thoraxen til hver mygg med tang, og plasser dem ventral side opp.Samle begge vingene ved hjelp av en skalpell, og plasser dem på et rent mikroskop lysbilde som inneholder en tørket dråpe monteringsmedium for videre måling ved hjelp av en gradert okular. Mål vingelengden med et stereoskop ved hjelp av et mikrometer. I denne studien ble ytelsen til kvinnelige anopheles mygg matet på det formulerte rike kunstige måltidet og myggene matet på det første flytende dietten, eller et ferskt blodmåltid sammenlignet.Antallet engorged kvinnelige mygg matet med rikt kunstig måltid på 89%var betydelig høyere enn antall engorged kvinner matet på blod på 56% F1 generasjon mygg matet på enten blodet eller det rike kunstige måltidet hadde sammenlignbar dødelighet og overlevelse. Variabiliteten var høyere i blodet matet mygg i forhold til mygg matet med det rike kunstige måltidet. Når det gjelder voksen kroppsstørrelse, var F1 anopheles mygg matet med rikt kunstig måltid innenfor forventet rekkevidde, og var lik blodmatet insektmygg.Etter min mening er det svært viktig å montere materne riktig med parafilmen for å unngå at det er brudd. Hvis membranen ikke er godt festet til glassmateren, kan du miste måltidet og sannsynligvis miste noen av myggene, da de kan dekkes av måltidet og dø. Vi ønsker å utføre en dual choice attraksjon analyse, for eksempel ved hjelp av et olfactometer slik at vi faktisk kunne vurdere om våre kvinner er mer tiltrukket av kunstig kosthold eller til blodet.Også, vi er nå lyofilizing kunstig kosthold og studerer det er stabilitet blant ulike temperaturer i lang tid. Foruten de åpenbare forbedringene av stabilitet og lagring som vi har jobbet med, bør den langsiktige bruken av dietten på myggtrening og fysiologi undersøkes. Jeg tror at å produsere anopheles uten blod vil lette enormt vektorforskning og implementering av kontrollverktøy som er avhengige av et stort antall mygg.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-deteksjon analysen for Malaria Sending Mygg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Opprettholde Aedes aegypti mygg infisert med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Den Murine kolin dårlig, Ethionine-supplert (CDE) kosthold modell av kroniske skader

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for Testing toksisitet av romanen Insecticidal kjemikalier til mygg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...