Name: a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Agradecemos a Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) pelo apoio técnico, Joana Gomes e Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) pela manutenção das colônias de mosquitos Anopheles. Financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/2011, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Ratos foram obtidos na casa de animais IHMT. Os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com a lei portuguesa e as diretrizes para o uso de animais de laboratório. A Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal aprovou todos os protocolos de estudo (aprovações de id: 023351 e 023355).
NOTA: Realize todos os ensaios alimentares em ~26 °C.
1. Mosquitos
<ol><li>Mantenha os mosquitos Anorfeles coluzzii (antiga forma Anopheles gambiae M) Yaoundé estirpe mosquitos a 26 °C, 75% de umidade um ciclo claro de 12 h:12 h. Abrigar mosquitos usando condições insetárias padrão para garantir o acasalamento.</li>
	<li>Cole filhotes de mosquito em um pequeno recipiente de água. Coloque o recipiente dentro de uma gaiola de mosquitos para deixar os mosquitos adultos emergirem e acasalem. Forneça 10% de solução de alimentação de glicose. Três dias após o surgimento coletam o número necessário de mosquitos da gaiola usando um aspirador.</li>
	<li>Um dia antes dos ensaios alimentares, remova a solução de alimentação de 10%. NOTA: Mosquitos de 3 dias de idade foram usados ao longo dos experimentos.</li>
</ol>2. Alimentação de mosquitos
<ol><li>Preparação de dietas líquidas artificiais<ol>
<li>Prepare as dietas líquidas artificiais em condições estéreis em um armário de fluxo laminar. Prepare a rica dieta líquida (r-liq_diet) adicionando o seguinte à dieta líquida inicial (i-liq_diet; O meio modificado da Eagle de Dulbecco [alta glicose com L-glutamina], veja tabela 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L de colesterol e 200 g/L de albumina de soro bovino (BSA). Misture todos os ingredientes completamente e filtre usando um microfiltro de 0,45 μm. NOTA: Não armazene as dietas; preparar dietas recém-saídos das soluções de estoque para cada experimento, pois perdem qualidade quando armazenados. Componentes das dietas são descritos na Tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coleta de sangue de rato<ol>
<li>Anestesia de 6 a 8 semanas de idade CD1 camundongos femininos (Mus musculus) com cetamina (120 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) utilizando a rota intraperitoneal.</li>
		<li>Realizar punção cardíaca (Figura 1) quando o rato não apresenta reação muscular em resposta a diferentes estímulos físicos (por exemplo, dores de dedo e cauda).</li>
		<li>Cole sangue usando uma seringa estéril de 1 mL com uma agulha de 27 G x 1/2 (0,4 x 12 mm2) que contém 100 μL de 1 mg/mL heparin (sal de sódio) para evitar a formação de coágulos sanguíneos. Mantenha o sangue a 37 °C usando um banho de água.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentação artificial<ol>
<li>Colete aproximadamente 30 mosquitos fêmeas da gaiola usando um aspirador.</li>
		<li>Transfira os mosquitos fêmeas para copos de papel de 500 mL e cubra com uma malha de rede de mosquitos fino para que eles não possam escapar. Aplique um alimentador de vidro conectado a tubos plásticos para manter um fluxo de água constante até a parte superior de cada xícara (Figura 2). Forneça um fluxo de água constante para a tubulação cilíndrica e alimentador para que a temperatura dentro seja mantida em aproximadamente 37,5 °C. NOTA: Um aparelho padrão de alimentação artificial de sino de vidro16 foi usado para fornecer as dietas formuladas aos mosquitos fêmeas.</li>
		<li>Estique a membrana de filme parafina através da boca do alimentador de vidro para conter a refeição.</li>
		<li>Pré-aqueça o i-liq_diet e o r-liq_diet a 37 °C usando um banho de água. Aplique 1 mL no alimentador de vidro. Alimente os mosquitos por 60 min no escuro com liq_diet, r-liq_diet ou sangue de rato fresco. Faça ensaios a 26 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avaliação da taxa de alimentação.<ol>
<li>Após a alimentação artificial, anestesiar os mosquitos a -20 °C por 30 s. Coloque os mosquitos em uma placa de Petri refrigerada.</li>
		<li>Registre o número de mosquitos fêmeas totalmente engordados (Figura 3). NOTA: A porcentagem de mosquitos alimentados é usada como proxy para o sucesso alimentar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Traços de História da Vida
<ol><li>Produção e fertilidade de ovos<ol>
<li>Transfira as fêmeas totalmente engorgadas, usando um pincel, para gaiolas individuais (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Mantenha os mosquitos em 26 ± 1 °C, 75% de umidade e um ciclo claro de 12 h:12 h: escuro com 10% de glicose ad libitum.</li>
		<li>Quarenta e oito h após a alimentação, adicione um papel filtro umidificado na parte inferior para a colocação de ovos(Figura 4). Conte os ovos em 48h e 72 h após a adição do papel de colocação de ovos usando uma lupa portátil. Inundar o papel filtro com água destilada para coletar os ovos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mortalidade larva<ol>
<li>Cole os ovos em bandejas (23 cm x 15 cm x 6 cm) preenchidas com água destilada(Figura 5). Mantenha o nível da água nas bandejas constantedurante os experimentos.</li>
		<li>Alimente as larvas diariamente com aproximadamente 13 mg de alimento de peixe moído por bandeja. Aplique um regime de alimentação semelhante a todas as bandejas de replicação.</li>
		<li>Remova pupas mortas e larvas diariamente. Finalize os experimentos quando todas as pupas se desenvolveram em adultos e contam o número de machos e fêmeas adultos.</li>
		<li>Registre as datas de eclosão e morte e calcule as taxas de mortalidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Longevidade<ol>
<li>Colete 15 homens adultos e 15 fêmeas adultas da geração f1 de cada grupo de dieta. Mantenha machos e fêmeas na mesma gaiola.</li>
		<li>Alimente adultos com uma solução de glicose 10% ad libitum. Remova os adultos mortos diariamente.</li>
		<li>Mantenha os mosquitos na mesma temperatura, umidade, condições do ciclo de luz e regime de alimentação de açúcar como descrito acima.</li>
		<li>Registre as datas de morte e calcule a longevidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medição do comprimento da asa<ol>
<li>Mosquitos adultos f1 de cinco dias de idade (masculino e feminino) de cada grupo de dieta a -20 °C para 90 s.</li>
		<li>um estereosor, segure suavemente o tórax de cada mosquito com fórceps e coloque-os laterais ventral para cima.</li>
		<li>Colete as duas asas usando um bisturi e coloque-as em um slide de microscópio limpo contendo uma gota seca de meio de montagem. Com a ajuda de uma agulha de 20 G adicione mídia de montagem extra às bordas do deslizamento de cobertura e lentamente abaixe o deslizamento de cobertura para as asas.</li>
		<li>Meça o comprimento da asa (Figura 6) com um estereoscópio usando um micrometro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2016).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).</li><li>Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+technologies+to+induce+sterility.">Transgenic technologies to induce sterility.</a> Malaria Journal. 8, 7 (2009).</li><li>Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. 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T., De Meillon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anophelinae+of+Africa+South+of+the+Sahara+(Ethiopian+zoogeographical+region).">The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region).</a> Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).</li><li>Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+in+insects.">Fat metabolism in insects.</a> Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).</li><li>Clifton, M. E., Noriega, F. 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J., Luckhart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-talk+between+nitric+oxide+and+transforming+growth+factor-beta1+in+malaria.">Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria.</a> Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).</li><li>Sumba, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daily+oviposition+patterns+of+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+Giles+(Diptera:+Culicidae)+on+different+types+of+aqueous+substrates.">Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates.</a> Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O sucesso de nossa dieta formulada sem sangue é provavelmente o resultado do efeito fisiológico sinérgico de todos os componentes adicionados ao i-liq_diet (rico em açúcar, aminoácidos, vitaminas e microelementos): BSA (fonte proteica), ATP (phagostimulant) e colesterol (fonte lipídica). A suplementação do r-liq_diet apenas com os componentes individuais não foi eficaz no estímulo à produção de ovos (dados não mostrados). Uma desvantagem do protocolo pode ser o custo de alguns dos componentes, como o colesterol. Mesmo assim, sua presença é fundamental, pois os insetos são incapazes de sintetizar19 e esta molécula é o precursor dos hormônios ecdysteroidques que regulam a síntese de gema e a maturação de ovos em artrópodes20. Menores quantidades de colesterol devem ser testadas para otimizar a quantidade necessária com o objetivo de reduzir custos e aumentar os benefícios da dieta artificial.
Outra limitação do método é que a dieta artificial deve estar recém-preparada a partir de soluções de estoque, pois uma vez preparada em sua forma líquida final perde qualidade após o armazenamento. No futuro, nossa dieta formulada poderia ser preparada como uma potência seca, semelhante ao SkitoSnackt, uma substituição artificial de farinha de sangue para mosquitos Aedes aegypti 21.
Além de fornecer os nutrientes necessários, uma refeição artificial precisa atrair e estimular mosquitos fêmeas a se alimentardamente da mesma forma que quando se alimentam de sangue fresco vertebrado. A dieta artificial sem sangue aqui descrita resultou em um aumento de 20% em mosquitos fêmeas totalmente engordados quando comparado com o grupo alimentado com sangue vertebrado. Essa medida indireta de atração poderia ser ainda mais esclarecida usando olfactômetros para confirmar que a dieta artificial é mais atraente e mais atraente para os mosquitos do que o sangue fresco.
O maior impacto da dieta na mortalidade larval foi observado para larvas derivadas de mosquitos alimentados com sangue, sugerindo que uma dieta artificial de composição estável pode contribuir para reduzir a mortalidade e melhorar o sucesso da reprodução de mosquitos quando comparada ao sangue fresco. O resultado menos previsível de uma refeição sanguínea pode surgir de variações hospedeiras na composição17 e da presença no sangue de moléculas que podem interferir na fisiologia do mosquito22. Os fatos anteriores enfatizam as vantagens para a criação de mosquitos de alta qualidade de dietas sem sangue fresco.
No geral, o número médio de ovos colocados em nosso estudo foi baixo em relação aos relatados em alguns insetários, mas o número médio de ovos ovipositados foi comparável à cepa de criação de laboratório de A. gambiae alimentada com sangue humano (22,6 ± 5,5 ovos/fêmea)23. Não foram observadas diferenças estatísticas significativas entre nossos grupos experimentais alimentados com sangue fresco ou nas refeições artificiais (Tabela 2),sugerindo que a implementação de um sistema de alimentação artificial de membrana com nossa dieta formulada é suficiente para manter e propagar colônias de mosquitos Anopheles em cativeiro.
Refeições artificiais sem sangue podem manter colônias aedes 22,mas quando aplicadas aos mosquitos Anopheles são de sucesso limitado ou nenhum11. Recentemente, uma refeição artificial à base de plasma para mosquitos Anopheles foi descrita24, mas as taxas de alimentação e o potencial reprodutivo foram baixos. Nossos resultados representam um avanço substancial no estado de arte (revisado por Gonzales e Hansen11) como nosso r-liq_diet formulado teve um desempenho semelhante ou melhor do que a refeição sanguínea de vertebrado padrão. Outras melhorias na estabilidade e no custo do armazenamento devem ampliar o escopo de sua aplicação.

Doenças transmitidas por vetores afetam vários milhões de seres humanos em todo o mundo e causam milhões de mortes a cada ano. Eles são transmitidos por insetos infectados com microrganismos produtores de doenças (protozoários, vírus) adquiridos quando se alimentam de sangue de um hospedeiro infectado. Posteriormente, o vetor infectado transmitirá o patógeno para um novo hospedeiro durante a próxima refeição de sangue. A malária é a doença mais mortal transmitida por vetores que é transmitida por várias espécies diferentes do mosquito Anopheles e afeta 40% da população mundial1. O parasita protista da malária é responsável por mais de 400.000 mortes por ano, das quais a maioria são crianças menores de 5 anos (Organização Mundial da Saúde). O mosquito Anopheles fêmea transmite o parasita da malária do gênero Plasmodium entre humanos e outros animais quando se alimenta de sangue vertebrado, um passo necessário para a produção e desenvolvimento de ovos2.
As estratégias atuais de erradicação da malária e outras doenças emergentes transmitidas por mosquitos vetors mortais dependem do desenvolvimento de estratégias inovadoras de controle de mosquitos3,4,5,que incluem a liberação na natureza de um grande número de mosquitos criados em insetículos. No entanto, um fator limitante crucial é a dependência de um fornecimento de sangue fresco para a criação e reprodução eficaz de mosquitos. A composição variável do sangue vertebrado pode impactar negativamente a fertilidade do mosquito e a forma física da progenia e pode limitar a confiabilidade e sustentabilidade das colônias de reprodução em cativeiro. Programas de liberação e controle de mosquitos exigem sistemas de produção de mosquitos em larga escala e um fornecimento regular de grandes quantidades de sangue vertebrado. Este é um grande obstáculo para a produção de mosquitos e levanta uma série de questões éticas associadas ao uso de animais vivos e limitações logísticas causadas pelas normas de segurança exigentes associadas. Isso torna os custos de manutenção e segurança das colônias de mosquitos elevados e desafia a sustentabilidade das práticas atuais de criação de mosquitos, particularmente em países de baixa renda, onde a ameaça da malária é muito maior.
Recentemente, pesquisas foram focadas no desenvolvimento de substitutos sanguíneos que imitam uma refeição de sangue vertebrado, mas até agora, apenas o sucesso limitado foi alcançado6,7,8,9. Uma dieta artificial bem sucedida precisa (1) provocar engorgement completo de mosquitos femininos, (2) desencadear a produção de vitellogenina, (3) produzir grandes lotes de ovos viáveis, e (4) gerar progenia saudável10. Além disso, as dietas artificiais possuem uma composição padrão e, portanto, são mais confiáveis para a produção de mosquitos para fins de pesquisa e controle. Dietas bem sucedidas sem sangue foram desenvolvidas para mosquitos Aedes (revisados por Gonzales e Hansen11),mas não para Anopheles spp. As dietas artificiais existentes contêm um phagostimulant (por exemplo, ATP10), uma fonte proteica para maturação de ovos6,12, carboidratos como fonte de energia, e aminoácidos (aa)13 que são fundamentais para a produção de óvulos e são um importante fator limitante para a fertilidade do mosquito14. Uma dieta artificial sem sangue também precisa fornecer colesterol15,o que melhora a produção de ovos. Aqui descrevemos uma dieta artificial sem sangue para mosquitos Anopheles fêmeas e demonstramos que ela tem um desempenho consistente e equivalente a uma refeição de sangue vertebrado de alta qualidade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A790G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>199342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (high glucose with L-glutamine)</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan mounting medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1079610100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassfeeder</td>
			<td>Local glazier</td>
			<td>by design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Pan Reac AppliChem</td>
			<td>A3004,0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalg&#232;ne 1000</td>
			<td>Merial, Portugal</td>
			<td>01MER122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G x 1&#34; 0.9 x 25 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>NN-2025R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6543-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Bayer, Portugal</td>
			<td>7427831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Millex-HV 0,45</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR25KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1ml, 27 G x &#189;&#34; 0.4 x 12 mm needle</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td>BS-NIN2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teich Mix Astra Pond</td>
			<td>Astra</td>
			<td>4030733100957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Flakes</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4004218742642</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a blood-free diet to rear anopheline mosquitoes

A pesquisa sobre malária requer condições de reprodução e produção em larga escala para mosquitos(Anopheles spp.) em cativeiro. A produção sustentável e confiável de mosquitos é atualmente inibida pelo fornecimento de sangue vertebrado fresco. Alternativas ao sangue são necessárias para promover estratégias eficientes de controle para malária e outras doenças transmitidas por vetores que são transmitidas por insetos que alimentam sangue. Com isso em mente, dietas líquidas artificiais foram formuladas como substitutos para sangue de vertebrado fresco. Aqui relatamos uma dieta líquida artificial sem sangue que fornece taxas de alimentação semelhantes ao sangue e imita os efeitos fisiológicos de uma refeição sanguínea de vertebrado fresco. A dieta induz o amadurecimento ovariano e ovo dos mosquitos Anopheles e também produz boa sobrevivência larval e desenvolvimento de adultos funcionais. A dieta líquida formulada sem sangue é um importante avanço para a reprodução sustentável de mosquitos em cativeiro e reduzirá os custos de manutenção das colônias de mosquitos e eliminará a necessidade de sangue vertebrado fresco.

Os resultados descritos abaixo comparam o desempenho de mosquitos Anopheles fêmeas alimentados com a rica refeição artificial formulada (r-liq_diet) e mosquitos alimentados com a dieta líquida inicial (i-liq_diet) ou uma refeição fresca no sangue. A dieta foi testada seguindo o protocolo esquemático retratado na Figura 7. O r-liq_diet descrito aqui faz parte de uma patente (PCT/IB2019/052967).
Porcentagem de fêmeas totalmente engorgadas
O número de mosquitos fêmeas engorgados alimentados com o r-liq_diet (89%) foi significativamente maior do que o número de fêmeas engorgadas alimentadas com sangue (56%) (Figura 8).
Fecundidade e fertilidade
A fecundidade feminina e a fertilidade para o primeiro ciclo gonotrófico foram utilizadas para avaliar a qualidade nutricional do liq_diet e r-liq_diet. Uma média de 24 ± 11 ovos foi colocado por fêmeas alimentadas com sangue de vertebrado fresco, enquanto as fêmeas alimentadas com r-liq_diet colocaram uma média de 25 ± 5 ovos (Tabela 2). Nenhuma colocação de ovos foi observada por fêmeas alimentadas com o liq_diet i.
Mortalidade na F-1
A aptidão dos mosquitos F1 foi avaliada entre colônias alimentadas com sangue vertebrado ou o r-liq_diet. Foram registradas larvas, pupas e mortalidade adulta. A variabilidade (erro padrão da média [SEM]) foi maior nos mosquitos alimentados pelo sangue(Figura 9 e Tabela 2) em relação aos mosquitos alimentados com o liq_diet r. A geração f1 de mosquitos alimentados com o sangue ou o r-liq_diet tinha taxas comparáveis de mortalidade e sobrevivência.
Expectativa de vida na F-1
Estima-se pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças que mosquitos adultos selvagens vivem por até um mês, mas provavelmente não sobrevivem por mais de 1 a 2 semanas e que os machos vivem por cerca de uma semana e se alimentam exclusivamente de néctar e outras fontes de açúcar. Observa-se que as diferenças na ingestão alimentar dos pais podem afetar a sobrevivência da progenia do mosquito17. Em nosso experimento, fêmeas adultas e machos no sangue (feminino 24,5 ± 6,8; masculino 18,5 ± 6,9) e r-liq_diet (feminino: 22,5 ± 8,1; masculino: 11,9 ± 6,9) grupos apresentaram média de expectativas de vida média semelhantes(Tabela 3) e as fêmeas apresentaram aumento de vida em relação aos machos.
Tamanho do corpo da F1
O comprimento da asa foi usado como indicador do tamanho do corpo adulto. Quando comparados com outras espécies, os adultos Anopheles são mosquitos de pequeno a médio porte com comprimento de asa entre 2,8 e 4,4 mm de comprimento da asa18. O tamanho do corpo adulto dos mosquitos F1 Anopheles alimentados pelo liq_diet r estava dentro da faixa esperada e era semelhante aos mosquitos insetários alimentados pelo sangue(Figura 10).
Análise estatística
Os dados apresentados representam a média de pelo menos três experimentos independentes (a menos que indicado de outra forma). As barras de erro representam o SEM. Quando os dados seguiram uma distribuição gaussiana, grupos independentes foram comparados usando o teste t do Aluno, caso contrário o teste Mann-Whitney foi aplicado. As diferenças entre os grupos alimentados com dieta artificial foram analisadas por meio do teste exato do Fisher e foram consideradas significativas em P ≤ 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> Figura 1: Coleta de sangue do rato CD1 por punção intracárdica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> Figura 2: Aparelho padrão de alimentação artificial. O alimentador de vidro contém r-liq_diet que está sendo alimentado com mosquitos Anopheles fêmeas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> Figura 3: Mosquitos Anopheles após alimentação artificial. Da esquerda para a direita: uma fêmea totalmente engorgada que foi oferecida r-liq_diet, mulher não engorgada que foi oferecida r-liq_diet, macho e totalmente engorgado fêmea que foi oferecido sangue de rato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> Figura 4: Ovos anopheles colocados 48 h pós-alimentação de fêmeas com o r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> Figura 5: Etapas de larvas L2 que se desenvolveram a partir dos ovos e foram coletadas em papel filtro e colocadas em bandejas contendo água destilada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> Figura 6: Asa direita de uma geração f1 de uma fêmea Anopheles coluzzii mosquito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> Figura 7: Protocolo esquemático de testes de dieta artificial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> Figura 8: As taxas de alimentação dos mosquitos fêmeas alimentaram dietas artificiais ou sangue. Asteriscos indicam diferenças significativas entre os mosquitos alimentados com as dietas r-líquido e i-líquido e o grupo de controle alimentado pelo sangue. Teste exato de Fisher de dois lados: ****P ≤ 0,0001 (risco relativo: 0,4828, 95% confiante Nível [CL]: 0,3776 a 0,6194) para dieta r-líquida versus sangue, *P = 0,0335 (risco relativo: 1.379, CL 95%: 1,044 a 1,836) para dieta líquida versus dieta líquida. Azul: não alimentado; vermelho: alimentado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> Figura 9: Efeito da refeição formulada sem sangue na mortalidade e proporção masculino/feminina dos mosquitos F1 Anopheles coluzzii. Três experimentos independentes foram realizados, cada um usando 30 mosquitos por dieta. Um t-test não emparelhado não mostrou diferenças significativas entre o grupo alimentado pelo sangue e o grupo alimentado r-liq_diet (Valores P variaram de 0,5047 a 0,8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> Figura 10: Comprimento da asa. A distância da incisão axial para a veia R4+5, excluindo o conjunto de franjas, foi usada para determinar o comprimento da asa. O tamanho foi avaliado para 5 fêmeas e 5 machos de cada grupo dietético (média ± SEM). Os valores são representados como a média ± SEM. Salmão: r-liq_diet; vermelho: sangue vertebrado. Teste t não emparelhado; ala esquerda feminina: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; ala esquerda masculina: t = 2.400, df = 8, P = 0,0432; ala direita feminina: t = 1.300, df = 8, P = 0,2298; ala direita masculina: t = 2.277, df = 7, P = 0,0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componentes</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Adenosine Triphosphate</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Álbum de Soro Bovino</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Colesterol</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de cálcio anidro</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de colina</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pantothenato de cálcio D (vitamina B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anidro de glicose D</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato ferriano nonahidrato</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido fólico</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicina</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-inositol</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monocloridor de l-arginina</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dihidrocloreto de l-cisto</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monohidrato monohidrocloreto l-histidina</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monocloridor de l-lisina</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-methionine</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-fenillánina</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-serine</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-threonine</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-triptofano</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hidrato de sal dimorsódio l-tyrosine</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-valine</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato de magnésio anidro</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niacinamida (nicotinamida)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vermelho fenol</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de potássio</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monocloridor de piridoxina</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sal de sódio ácido piruvic</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riboflavina (vitamina B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bicarbonato de sódio</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de sódio</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anidro monobásico de fosfato de sódio</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amonoclorato de tiamina (vitamina B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*Somente em R-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: A composição da dieta i-líquida e dieta r-líquido.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Número total do ovo (± SEM)</td>
			<td>Ovos/fêmea (± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sangue</td>
			<td>733 ± 330</td>
			<td>24 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 ± 164</td>
			<td>25 ± 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Lotes de ovos produzidos por fêmeas Anopheles coluzzii. Três experimentos independentes foram realizados para cada dieta experimental usando 30 mosquitos fêmeas em cada um.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Fêmeas (dias ± SEM)</td>
			<td>Machos (dias ± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sangue</td>
			<td>24,5 ± 6,8</td>
			<td>18,5 ± 6,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22,5 ± 8,1</td>
			<td>11,9 ± 6,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Expectativa de vida dos mosquitos F1 Anopheles. A longevidade dos mosquitos F1 da F0 alimentada artificialmente foi avaliada registrando as datas de nascimento e morte de cada mosquito proveniente do mesmo grupo alimentar (15 fêmeas e 15 machos foram seguidas). Os resultados são representados como a média da vida útil do mosquito por grupo diet.

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A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Um protocolo é apresentado para a formulação de uma dieta artificial sem sangue para alimentar mosquitos Anopheles em cativeiro. Esta dieta tem um desempenho semelhante ao sangue vertebrado e desencadeia oogênese e maturação de ovos e produz descendência adulta viável.

Uma dieta sem sangue para mosquitos de anophelina traseira

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Parasitas da malária, como os de mosquitos que desempenham um papel importante na disseminação da doença. Até agora, tem sido impossível criar mosquitos da malária sem sangue. E para superar essa limitação, nosso protocolo descreve uma dieta substituta de sangue que é capaz de suportar a criação de mosquitos na insenseção.O uso de dieta sem sangue é altamente vantajoso sobre o sangue. Uma dieta sem sangue não tem as restrições éticas como o uso de sangue humano, ou animais experimentais. Substituir animais em experimentação faz parte da nossa política de três R.Substitua, reduza, refine. Não usar sangue reduz custos, e a logística associada à coleta, armazenamento e manutenção de sangue vermelho. O uso de dietas artificiais pode facilitar o teste de moléculas anti plasmodium.Até agora, testamos nossas dietas usando diferentes espécies de anopheles. Em todas elas, a dieta foi bem engorgada pelas fêmeas e permitiu a produção e colocação de ovos. Acreditamos que esta dieta tem potencial de uso para a criação de outras espécies de mosquitos.Na verdade, estamos agora testando para aedes, um vetor de muitas doenças como dengue, zika vírus ou febre amarela. Mantenha os mosquitos de cepa anopheles coluzzii yaonde em uma sala a 26 graus Celsius, 75% de umidade e sob um ciclo escuro claro de 12 horas a 12 horas. Mosquitos domésticos usando condições de insetídula padrão em uma única gaiola para garantir o acasalamento.Use uma pipeta de plástico para coletar pupas de mosquito em um pequeno recipiente de água. Coloque o recipiente dentro de uma gaiola de mosquitos para deixar os mosquitos adultos emergirem e acasalarem. Fornecer solução de alimentação de 10% glicose na gaiola.Três dias após o surgimento, use um aspirador para coletar o número necessário de fêmeas da gaiola de estoque em um copo de papel. Para distinguir, as fêmeas são maiores e os machos têm um proboscis mais largo e emplumado. Um dia antes de alimentar trilhas, remova a solução de alimentação de 10% glicose.No dia seguinte, prepare dietas líquidas artificiais em condições estéreis no armário de fluxo laminar de acordo com o manuscrito. Adicione todos os ingredientes a um tubo de plástico. Misture bem todos os ingredientes e filtre usando um microfiltro de 0,45 mícrons.Encha uma seringa estéril de 1 mililitro equipada com uma agulha de meia polegada de calibre 27 com 100 microliters de um miligrama por mililitro de heparina. Em seguida, anestesiar cd de seis a oito semanas de idade um camundongos fêmeas com cetamina e xilazina usando a rota intra peritoneal. Avalie se o mouse exibe alguma reação muscular e resposta a diferentes estímulos físicos.Faça a punção cardíaca. Em seguida, coletar sangue do rato em um micro tubo e manter o sangue a 37 graus Celsius em um banho de água. Em seguida, recolhe aproximadamente 30 mosquitos fêmeas da gaiola usando um aspirador.Transfira os mosquitos fêmeas para copos de papel de 500 mililitros e cubra com uma malha fina de rede de mosquitos para que eles não possam escapar. Estique a membrana do parafilme através da boca do alimentador de vidro para conter a refeição. Aplique um aparelho de alimentação artificial de sino de vidro conectado a tubos plásticos na parte superior de cada xícara.Forneça um fluxo de água constante para o tubo cilíndrico e alimentador para que a temperatura dentro seja mantida em aproximadamente 37,5 graus Celsius. Aplique um mililitro de dieta líquida pré-armada a 37 graus Celsius ou sangue de rato fresco em um alimentador de vidro. Alimente os mosquitos por 60 minutos no escuro em 26 graus Celsius.Após a alimentação artificial, o frio anestesia os mosquitos a 20 graus Celsius por 30 segundos. Em seguida, coloque os mosquitos em uma placa de Petri refrigerada. Regisso número de mosquitos fêmeas totalmente engorgados.Separe 30 fêmeas totalmente engorgadas e coloque-as em uma nova gaiola. Agora, coloque um papel filtro umidificado na parte inferior de cada gaiola. Mantenha os mosquitos a 26 graus Celsius, 75% de umidade, e sob um ciclo escuro claro de 12 horas a 12 horas com 10% de glicose ad libitum.Às 96 horas e 120 horas após a alimentação, conte os ovos com a ajuda de uma lupa portátil. Inunde o papel filtro com água destilada para coletar os ovos em bandejas cheias de água destilada. Alimente as larvas diariamente com aproximadamente 13 miligramas de alimentos moídos por bandeja.Remova pupas mortas e larvas com uma pipeta de plástico diariamente. Quando todas as pupas se desenvolveram em adultos, conte o número de machos e fêmeas adultos, registre as datas de eclosão e morte e calcule as taxas de mortalidade. Para testar a longevidade, colete 15 homens adultos e 15 fêmeas adultas da geração F1 de cada grupo dietético em um copo de papel.Alimente adultos com solução de glicose de 10% ad libitum. Use pinças ou um pincel para remover os adultos mortos diariamente. Mantenha os mosquitos na mesma temperatura, umidade, condições de ciclo leve e regime de alimentação de açúcar.Registre as datas de óbito e calcule a longevidade. Para medir o comprimento da asa, anesthetize cinco dias de idade F1 mosquitos adultos machos e fêmeas de cada grupo dietético a 20 graus Celsius por 90 segundos. Sob um estereóscópio, segure suavemente o tórax de cada mosquito com fórceps, e coloque-os de lado ventral para cima.Colete ambas as asas usando um bisturi, e coloque-as em um slide de microscópio limpo contendo uma gota seca de meio de montagem para medição posterior usando uma ocular graduada. Meça o comprimento da asa com um estereoscópio usando um micrômetro. Neste estudo, foi comparado o desempenho de mosquitos anofelinos fêmeas alimentados com a rica refeição artificial formulada e mosquitos alimentados com a dieta líquida inicial, ou uma refeição de sangue fresco.O número de mosquitos fêmeas engorgadas alimentadas com rica refeição artificial em 89% foi significativamente maior do que o número de fêmeas engorgadas alimentadas com sangue em 56%A geração de mosquitos F1 alimentados com o sangue ou a rica refeição artificial tinha taxas de mortalidade e sobrevivência comparáveis. A variabilidade foi maior nos mosquitos alimentados com sangue em relação aos mosquitos alimentados com a rica refeição artificial. Em termos de tamanho corporal adulto, os mosquitos anopheles F1 alimentados com rica refeição artificial estavam dentro da faixa esperada, e era semelhante aos mosquitos insetos alimentados pelo sangue.Na minha opinião, é muito importante montar os alimentadores corretamente com o parafilme para evitar sua ruptura. Se a membrana não estiver bem ligada ao alimentador de vidro, você pode perder a refeição e provavelmente perder alguns dos mosquitos, pois eles podem ser cobertos pela refeição e morrer. Gostaríamos de realizar um ensaio de atração de dupla escolha, por exemplo, usando um olfactômetro para que pudéssemos realmente avaliar se nossas fêmeas são mais atraídas pela dieta artificial ou pelo sangue.Além disso, estamos agora liofilizando a dieta artificial e estudando sua estabilidade entre diferentes temperaturas há muito tempo. Além das melhorias óbvias na estabilidade e no armazenamento em que estamos trabalhando, o uso a longo prazo da dieta sobre o condicionamento físico e fisiologia do mosquito deve ser investigado. Acredito que a produção de anofelinos sem sangue facilitará imensamente a pesquisa vetorial e a implementação de ferramentas de controle que dependem de um grande número de mosquitos.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Biologia

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissecção das glândulas salivares e intestino médio de Ae. aegypti mosquitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Impedir a propagação da malária e dengue por meio de mosquitos geneticamente modificados

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

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Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

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O murino colina deficiente, Ethionine-completada (CDE) dieta modelo de lesão hepática crônica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...