Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

نشكر الدكتورة جنيفر فوكس وأعضاء مختبر خاليمونشوك على التعليقات الثاقبة. ونحن نعترف بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM108975 إلى O.K. و T32 GM107001-01A1 إلى E.M.G.).

1- إعداد وجمع الديدان القديمة لعزل الخلايا
ملاحظة: موضح أدناه هو عزل الخلايا العصبية الكولينية من سلالة الأمم المتحدة الكولينية المعدلة وراثيا-17:: GFP (OH13083) التي تم الحصول عليها من مركز علم الوراثة Caenorhabdititis (CGC) مستودع سلالة في جامعة مينيسوتا. لا بد من الحفاظ على ظروف م?...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

الدودة المستديرة C. elegans هو نموذج راسخة وقوية لدراسة صحة الخلايا العصبية والمرض2. مع أدوات وراثية وافرة للتعامل مع هذه الحيوانات وكمية يمكن التحكم فيها من أنواع الخلايا العصبية المختلفة التي تم تعيينها بدقة، يمكن جمع قدر كبير من البيانات مع كمية صغيرة نسبيا من المواد. هنا?...

على مدى العقود العديدة الماضية، كان الكائن الحي النموذجي الميتازوان Caenorhabditis elegans رصيدا هائلا في دراسة الخلايا العصبية، والدوائر العصبية ودورها في الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية، والشيخوخة المرتبطة العصبية الامراض. ميزة فريدة من نوعها من C. elegans هو أن الحيوانات شفافة، مما يسمح لسلالة جميع الخلايا الجسدية الكبار ليتم تعيينها1. C. elegans أيضا يأوي كمية يمكن التحكم فيها من الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى مورفولوجيا واتصال الجهاز العصبي يجري فهمها جيدا2. سلالة الخلايا الثابتة، وعمر قصير، ووفرة من الأدوات الوراثية عالية الإنتاجية المتاحة لC. elegans تجعل من كائن حي نموذج مثالي لدراسة الشيخوخة داخل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة.
شيخوخة الخلايا العصبية والاضطرابات العصبية معقدة، ولكل اضطراب التوقيعات المرضية فريدة من نوعها المرتبطة به. ومع ذلك، بالنسبة للعديد من هذه الاضطرابات، مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر، سمة مشتركة هي الحمل التدريجي للبروتينات غير مطوية3،4،5. في كل من هذه الأمراض، والبروتينات misfold والكلي داخل الخلية لتسبب سمية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلية4،5. للشيخوخة السليمة للخلايا العصبية ، فإن التوازن من الميتوكوندريا ، وعلى وجه التحديد التوازن البروتيني ، مهم ، كما الاضطرابات وdyshomeostasis يمكن أن يؤدي إلى تنكس الأعصاب6،7،8. وقد تم تجهيز الخلايا مع آليات مختلفة للحفاظ على التوازن البروتين، واحد هو استجابة البروتين تتكشف (الاستعراض الشامل)، وهو مسار كلاسيكي حيث إشارات من الشبكية endoplasmic (ER) تنشيط تتالي الإشارات داخل الخلايا، مما يؤدي إلى النسخ الرد9. أقرب إلى هذا النظام الشاملER، metazoans عرض استجابة مماثلة لفقدان التوازن البروتين الميتوكوندريا ، ما يسمى الميتوكوندريا UPR (UPRMT)7،8. C. elegans يبدو أن الكائن الحي القاعدية الأكثر أن يكون مؤكد ومحدد جيدا مسارMT التقارير UPR7.
وظيفة / خلل السكان الخلايا العصبية محددة داخل شبكة أكبر يمكن أن يكون من الصعب تقييم بسبب اتصالها الجوهرية والتعقيد3. ومع ذلك، غالباً ما تكون هناك حاجة لدراسة مجموعات الخلايا العصبية المتميزة بسبب الأمراض الخاصة بنوع الخلية مع الأمراض المعقدة، مثل تلك المرتبطة بضعف توازن البروتين الخلوي. في C. elegans, يمكن التلاعب بمجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا مما يسمح بالمراقبة السهلة في الجسم الحي. الجهاز العصبي من C. elegans يتكون في المقام الأول من الخلايا العصبية ، مع نسبة صغيرة من الخلايا الدبقية. في الديدان hermaphrodite الكبار، وهناك ما يقرب من 302 الخلايا العصبية، مقسمة إلى أكثر من 100 فئات مختلفة2،10. الخلايا العصبية مثل الخلايا العصبية الكولينية تهيمن في تقاطعات العصبية العضلية، في حين تشارك الخلايا العصبية الدوبامين في المقام الأول في الإحساس10،11. كما كل من النشاط الحركي والقدرات الحسية تنخفض مع التقدم في السن، فمن المهم أن تفاصيل الرؤى الميكانيكية حول العيوب في هذه الخلايا العصبية الفردية11،12. على هذا النحو، هناك حاجة إلى طريقة بسيطة وقوية لعزل الخلايا السليمة ذات الأهمية للدراسات اللاحقة في الجسم الحي السابق.
هنا، ونحن نصف طريقة فعالة الأمثل للعزل السريع للخلايا العصبية محددة تعبر عن البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من C. elegans. ويمكن إجراء طريقة العزل هذه على الديدان اليرقات أو الأحداث أو البالغين. وقد سبق أن نشر تشانغ وآخرونعزل الخلايا عن الديدان اليرقانية ولن تناقش هنا. ملاحظة هامة هنا هو أن جميع الديدان تحتاج إلى أن تكون في نفس مرحلة الحياة لمنع الإفراط في الهضم من الحيوان أو التلوث من الحيوانات في مراحل الحياة المختلفة. من خلال كل من اضطراب الأنزيمية والميكانيكية من بشرة الديدان الخيطية، وهو هيكل خارجي عالية في الكولاجين والبروتينات الهيكلية الأخرى، يمكن عزل مجموعة واسعة من الخلايا13،14. ثم يمكن عزل الخلايا عن طريق قياس التدفق المقطعي أو الأجسام المضادة المسماة الخرز المغناطيسي. عادة، يتم عزل الحمض النووي الريبي عن طريق طريقة الفينول وانييدين إيزوثيوسينات لضمان إثراء السكان الخلية المطلوب15. مع الكثير من الرعاية يمكن الحفاظ على هذه الخلايا المعزولة في قارورة الثقافة أو طبق متعدد الآبار. هذه الطريقة تمثل أداة فريدة وقوية في دراسة الخلايا العصبية محددة ولها القدرة على عزل الخلايا الحية والوظيفية لمزيد من الزراعة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

خلال عملية الشيخوخة ، تتراكم العديد من الخلايا مستويات عالية من الضرر مما يؤدي إلى خلل في الخلايا ، والتي تكمن وراء العديد من حالات الشيخوخة والمرض. تمثل الخلايا العصبية ما بعد الميكوتيك نوع خلية رئيسية تتأثر بالشيخوخة. على الرغم من وجود نماذج الثدييات متعددة من الشيخوخة العصبية، فهي صعبة ومكلفة لإنشاء. الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans هو نموذج قوي لدراسة الشيخوخة العصبية، كما أن هذه الحيوانات لديها عمر قصير، والأدوات الوراثية القوية المتاحة، والجهاز العصبي مفهرسة جيدا. الطريقة المعروضة هنا تسمح بالعزل السلس لخلايا محددة استناداً إلى التعبير عن بروتين فلورسنت أخضر المعدل وراثياً (GFP). يتم هضم خطوط الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP تحت المروجين متميزة، نوع الخلية محددة لإزالة بشرة الخارجي وتعطيل ميكانيكيا بلطف لإنتاج الطين التي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا. ثم يتم فصل الخلايا ذات الأهمية من الخلايا غير المستهدفة من خلال فرز الخلايا المنشطة بالفلورة، أو بواسطة الخرز المغناطيسي المضاد لGFP. ويمكن بعد ذلك استزراع الخلايا المعزولة لفترة محدودة أو استخدامها على الفور لتحليل الجسم الحي السابق الخاص بالخلايا مثل التحليل النسخي عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي. وهكذا، يسمح هذا البروتوكول لتحليل سريع وقوي للاستجابات الخاصة بالخلايا داخل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة في C. elegans.

يسمح البروتوكول الموضح هنا لعزل محدد للخلاياالعصبية الكولينية الإيجابية GFP من الدودة المستديرة C. elegans للدراسات اللاحقة في الجسم الحي السابق مثل تحديد سمات التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية وفي نهاية المطاف على المدى القصير زراعة لقياسات الفيزيولوجيا الكهربائ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans

هنا، نقدم بروتوكول لعزل بسيط لمجموعات محددة من الخلايا العصبية الحية التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر من خطوط Caenorhabditis elegans المعدلة وراثيا. هذه الطريقة تمكن مجموعة متنوعة من الدراسات في الجسم الحي السابق التي تركز على الخلايا العصبية محددة ولها القدرة على عزل الخلايا لمزيد من الزراعة على المدى القصير.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

يسمح هذا البروتوكول بالعزل السلس، والاستزراع، والاستجواب للاستجابات النسخية في نسب خلايا محددة من C.elegans. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي مستوى عال من القدرة على التكيف مع مراحل الحياة المختلفة للدودة أو أنواع محددة من الخلايا التي سيتم عزلها. سأبرهن على العملية أنا وناتالية زاهايكو، وهي فنيّة من مختبرنا.بعد جمع الحيوانات، الطرد المركزي لهم في 1600 مرات ز لمدة خمس دقائق. إزالة كل من افرا و resuspend الديدان في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام M9. نقل التعليق إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي في 1600 مرة ز لمدة خمس دقائق ل بيليه الديدان. ثم إضافة 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت SDS-DTT واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يجب أن تظهر الديدان الآن أن تكون مجعدة على طول الجسم إذا كان ينظر إليها تحت المجهر الخفيف.بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولترات من عازلة العزلة الباردة الجليدية واخلطها عن طريق النقر بلطف على الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ل بيليه الديدان. إزالة افرات وغسل مع ملليلتر واحد من العازلة العزل.كرر عملية الطرد المركزي وغسل ما مجموعه خمس مرات، مع التأكد من إزالة المخزن المؤقت في كل مرة. بعد هذا، إضافة 100 ميكرولترس من خليط البروتياز من ستربتومايس غريسوس، حل في عازلة العزلة، إلى بيليه. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة، مع التأكد من تطبيق تعطيل الميكانيكية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 60 إلى 70 مرة مع طرف ميكروبيبيت 200 ميكرولتر ضد الجزء السفلي من الأنبوب.لتحديد مرحلة الهضم، إزالة واحد إلى خمسة ميكرولترات من خليط الهضم، وإسقاطه على شريحة زجاجية، وتفتيشه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة. بعد خمس إلى سبع دقائق، يجب أن يكون لشظايا الدودة بشرة مخفضة بشكل واضح وسيكون الطين من الخلايا مرئيًا بسهولة. وقف رد الفعل بإضافة 900 ميكرولترات من Leibovitz المتاحة تجاريا L-15 المتوسطة، وتستكمل مع 10٪ FBS والبنسلين شتربتوميسين.أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الشظايا المعزولة والخلايا. غسل الخلايا بيليه مرتين أكثر مع وسائل الإعلام L-15 الباردة المكملة باستخدام ملليلتر واحد من وسائل الإعلام في غسل. resuspend الخلايا بيليه في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام L-15 تكمل, وتترك على الجليد لمدة 30 دقيقة.ثم تأخذ الطبقة العليا، والتي هي ما يقرب من 700 إلى 800 ميكرولتر، ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge. استخدام عداد الخلايا الآلي أو قياس كثافة الخلية من 10 إلى 25 ميكرولترات من الخلايا المعزولة. خلايا الطرد المركزي من تعليق الخلية المعزولة في 10،000 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق.تخلص من الخلايا الفائقة و resuspend في L-15 تكمل المتوسطة إلى كثافة الخلية التي لا تزيد عن ستة ملايين خلية لكل ملليلتر لتجنب الحمولة الزائدة على جهاز قياس التدفق. ثم، فرز الخلايا حسب تعبير إيجابي GFP باستخدام مقياس تدفق الخلايا قادرة على فرز العينات. يمكن استخدام الخلايا السلبية GFP كتحكم في التحليل غير النوع الخلية.بعد ذلك، قم بطبق الخلايا المعزولة في آبار صفيحة ستة آبار معقمة، ضع اللوحة في وعاء بلاستيكي، أضف مسح رطب أو ورق من الأنسجة الرخوة لإضافة الرطوبة إلى الخلايا، واحتضان في 20 درجة مئوية. خلايا الطرد المركزي من تعليق الخلية المعزولة في أنبوب RNase 1.5 ملليلتر خالية من microcentuge في 10،000 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام micropipette، وإزالة عظمى وإضافة 100 ميكرولترات من M9 المتوسطة لغسل بعيدا المتوسطة L-15 المكملة.بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 10،000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وإزالة فائقة. كرر عملية الغسل والطرد المركزي ثلاث مرات المجموع لضمان إزالة جميع وسائل الإعلام، مع التأكد من إزالة بعناية عظمى في كل مرة. ثم، إضافة ملليلتر واحد من الفينول وguanidine حل متساوي التمامية للخلايا والماصات تعليق صعودا وهبوطا بعناية.احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من الكلوروفورم وعكس بلطف الأنبوب 15 إلى 20 مرة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. استخدام micropipette لإزالة بعناية أكبر قدر من الطبقة مائي أعلى ممكن، مع التأكد من عدم إزعاج الطبقات العضوية السفلية. نقل الطبقة السفلية إلى جديد 1.5 ملليلتر RNase خالية من microcentrifuge أنبوب.إلى أنبوب جديد، إضافة 500 ميكرولترات من الايزوبروبانول ومزيج عن طريق عكس الأنبوب. احتضان هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 14، 000 مرات ز و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.ضع العينات على الجليد واستخدم ميكروسيبيت لإزالة أكبر قدر ممكن من الأيزوبروبانول. أضف برفق ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول في الماء المقطر المزدوج الخالي من RNase إلى الأنبوب عن طريق تطبيقه على جانب الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.إزالة معظم الإيثانول والسماح للأنبوب الهواء الجاف على الجليد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 15 إلى 20 ميكرولترات من المياه المقطرة المزدوجة الخالية من RNase. استخدم مقياس طيفي في 260 نانومتر لقياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاوته.في هذه الدراسة، unc-17:GFP إيجابية cholinergic الخلايا العصبية يتم استخراجها وعزلها من الدودة المستديرة C.elegans لدراسات لاحقة السابقين فيفو. يتم التعبير عن الجين unc-17 في جميع أنحاء الجسم C.elegans، ورموز لنقل أستيل عبر الميكبران في الوريد. التعبير عن هذا الجين يمكن ملاحظته في الرأس، والخلايا العصبية في الجسم المتوسط، والذيل، وإسقاطات الخلايا العصبية.تظهر هنا صور ميكروجرافية مُنمَرة من unc-17: الخلايا العصبية الإيجابية بعد العزلة، بالإضافة إلى التحكم السلبي في الحيوانات غير المعدلة من نوع N2. يمكن أن تبقى الخلايا المعزولة على قيد الحياة لمدة تصل إلى ثلاثة أيام عندما تستكمل مع L-15 L-15 متوسطة و 10٪ FBS. تظهر هنا بيانات تمثيلية لـ qPCR من الخلايا العصبية الكوللينية المعبرة عن GFP ، بالإضافة إلى خلايا العضلات المعبرة عن GFP.بعد فرز الخلايا بنجاح، يتم عزل RNA عن طريق طريقة الفينول وguanidine isothiocyanate، وبعد ذلك تم إنتاج cDNA باستخدام مجموعة توليفية. التعبير عن الجينات الكولينيرية الخاصة بالخلايا العصبية، TPH-1، هيدروكسيلاس التربتوفان، وsnb-1، وهو ناقل الحوية متشابك، مرتفعة في unc-17:GFP الخلايا المعزولة. ومع ذلك، هذا التعبير غير موجود في خلايا معزولة ميو-3:GFP.المعكوس صحيح مع التعبير عن نسخة سلسلة الميوسين الثقيلة للعضلات من ميو-2 ، حيث يقتصر التعبير عن هذا الجين على خلايا العضلات المعزولة ، ولكن ليس الخلايا الكولينية المعزولة. من المهم احتضان الديدان بالكامل. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي حضانة الموسعة من بشرة الدودة في موت دودة أو إجهاد إضافي للحيوان.بعد العزل، يمكن أن تكون الخلايا إما مثقف لفترة من الزمن، أو استخدامها لعزل RNA وتحليل qRT-PCR. يمكن تحليل الخلايا العصبية المستزرعة عن طريق قياسات الالكتروفوريس المشبك التصحيح. قد تسهل هذه التقنية تحليل الخلايا الحية السابقة لمجموعات محددة من الخلايا، مما يساعد على تحسين فهمنا للاستجابات الخاصة بالخلايا في سياق الكائنات متعددة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة حياتها.وبما أن المواد الكيميائية مثل SDS وDTT تستخدم أثناء هذه التجربة، ينبغي اتباع إجراءات السلامة المختبرية العامة أثناء صنع واستخدام المخازن المؤقتة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...