Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi takker Dr. Jennifer Fox og medlemmerne af Khalimonchuk laboratorium for indsigtsfulde kommentarer. Vi anerkender den støtte fra de nationale institutter for sundhed (R01 GM108975 til O.K. og T32 GM107001-01A1 til E.M.G.).

1. forberedelse og indsamling af gamle orme til celle isolation
Bemærk: forklaret nedenfor er isolering af kolinerge neuroner fra den transgene UNC-17:: gfp stamme (OH13083) opnået fra Caenorhabditis genetik Center (CGC) stamme repository på University of Minnesota. Det er bydende nødvendigt at opretholde sterile forhold for at forhindre kontaminering fra svampe eller bakterier.
<ol><li>Forbered og Synkroniser orme via blegning metode som beskrevet af T. Stiernagle<sup ...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

Rundorm C. elegans er en veletableret og kraftfuld model til at studere neuronal sundhed og sygdom2. Med rigelig genetiske værktøjer til at manipulere disse dyr og håndterbare mængde af præcist kortlagt forskellige neuron typer, en stor del af data kan indsamles med en relativt lille mængde materiale. Her skitserer vi en optimeret metode til at isolere forskellige neuroner fra hele dyr. Ved at forstyrre ormen ydre neglebånd proteiner, en gylle af forskellige celletyper kan isoleres...

I løbet af de sidste mange årtier, den metazoiske model organisme Caenorhabditis elegans har været et enormt aktiv i studiet af neuroner, neuronal kredsløb og dens rolle i fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, og aldrende-associerede neurodegenerative Sygdomme. Et unikt træk ved C. elegans er, at dyrene er gennemsigtige, hvilket gør det muligt for alle voksne somatiske cellernes afstamning at blive kortlagt1. C. elegans også havne håndterbare mængde af neuroner, fører til morfologi og tilslutningsmuligheder i nervesystemet er godt forstået2. Den invariant celle Lineage, kort levetid, og overflod af High-gennemløb genetiske værktøjer til rådighed for C. elegans gør det til en ideel model organisme til studiet af aldring inden for forskellige neuronal populationer.
Aldring af neuroner og neurodegenerative lidelser er komplekse, og hver lidelse har unikke patologiske signaturer forbundet med det. Men for mange af disse lidelser, såsom Parkinsons og Alzheimers sygdom, et fælles træk er den progressive belastning af misfoldede proteiner3,4,5. I begge disse sygdomme, misfoldes og aggregerer proteiner i cellen for at forårsage toksicitet, hvilket i sidste ende fører til celledød4,5. For korrekt aldring af neuroner, den homøostase af mitokondrier, mere specifikt protein homøostase, er vigtigt, som forstyrrelser og dyshomeostase kan føre til neurodegeneration6,7,8. Celler er udstyret med forskellige mekanismer til at opretholde protein homøostase, hvoraf den ene er den udfoldet proteinrespons (UPR) – en klassisk vej, hvor signaler fra endoplasmatiske reticulum (er) aktiverer intracellulære signal kaskader, hvilket fører til en transkriptional svar9. Beslægtet med denne UPRer, metazoans vise en lignende respons på tab af mitokondrie protein homøostase, den såkaldte mitokondrie UPR (UPRMT)7,8. C. elegans synes at være den mest basale organisme til at have en bekræftet og veldefineret UPRMT pathway7.
Funktionen/dysfunktion af specifikke neuronal populationer i et større netværk kan være vanskeligt at vurdere på grund af deres iboende konnektivitet og kompleksitet3. Men, der er ofte et behov for at studere særskilte neuronal populationer på grund af celletype-specifikke sygdomme med komplekse patologier, såsom dem forbundet med nedsat cellulære protein homøostase. I C. elegans, specifikke neuronal populationer kan genetisk manipuleret giver mulighed for facile observation in vivo. Nervesystemet af C. elegans består primært af neuroner, med en lille procentdel af gliale celler. I voksne hermafrodit orme, der er ca 302 neuroner, opdelt i over 100 forskellige klasser2,10. Neuroner som kolinerge neuroner dominerer i neuromuskulære vejkryds, mens dopaminerge neuroner primært er involveret i sensation10,11. Da både motorisk aktivitet og sensoriske evner falder med alderen, er det vigtigt at detaljeret mekanistisk indsigt om defekter i disse individuelle neuroner11,12. Der er derfor behov for en enkel og robust metode til isolering af intakte celler af interesse for efterfølgende ex vivo-undersøgelser.
Her beskriver vi en optimeret effektiv metode til hurtig isolering af specifikke neuronal celler, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) fra C. elegans. Denne isolationsmetode kan udføres på larve, Juvenile eller voksne orme. Isolering af celler fra larve Worms blev tidligere udgivet af Zhang et al.13 og vil ikke blive diskuteret her. En vigtig bemærkning her er, at alle orme skal være på samme livstrin for at forhindre over fordøjelse af dyret eller kontaminering fra dyr i forskellige livsstadier. Gennem både enzymatisk og mekanisk afbrydelse af fyrretræsnematoden neglebånd, et Exoskelet højt i kollagen og andre strukturelle proteiner, kan en bred vifte af celler isoleres13,14. Cellerne kan derefter isoleres via flowcytometri eller antistof mærket magnetiske perler. Typisk er RNA isoleret via en phenol og guanidin isothiocyanat metode til at sikre berigelse af den ønskede cellepopulation15. Med megen omhu kan disse isolerede celler vedligeholdes i en dyrknings kolbe eller en multi-brønd skål. Denne metode repræsenterer et unikt og kraftfuldt værktøj i studiet af specifikke neuroner og har kapacitet til at isolere levende og funktionelle celler til yderligere dyrkning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Under aldringsprocessen, mange celler ophobes høje niveauer af skader, der fører til cellulære dysfunktion, som ligger til grund for mange geriatriske og patologiske forhold. Post-mitotiske neuroner repræsenterer en større celletype påvirket af aldring. Selv om flere pattedyr modeller af neuronal aldring findes, de er udfordrende og dyre at etablere. Den rundorm caenorhabditis elegans er en kraftfuld model til at studere neuronal aldring, da disse dyr har kort levetid, en tilgængelig robust genetisk værktøjskasse, og godt katalogiseret nervesystem. Den metode, der præsenteres heri, giver mulighed for problemfri isolering af specifikke celler baseret på ekspression af et transgene grønt fluorescerende protein (GFP). Transgene dyre linjer, der udtrykker GFP under særskilte, celletype-specifikke initiativtagere er fordøjet for at fjerne den ydre neglebånd og forsigtigt mekanisk forstyrret til at producere gylle, der indeholder forskellige celletyper. De celler af interesse er derefter adskilt fra ikke-målceller gennem fluorescens-aktiverede celle sortering, eller ved anti-GFP-koblede magnetiske perler. De isolerede celler kan derefter dyrkes i en begrænset periode eller straks anvendes til celle specifikke ex vivo-analyser, såsom transkriptional analyse af realtids kvantitativ PCR. Således, denne protokol giver mulighed for hurtig og robust analyse af celle-specifikke reaktioner inden for forskellige neuronal populationer i C. elegans.

Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for specifik isolering af UNC-17:: gfp-positive kolinerge neuroner fra rundorm C. elegans til efterfølgende ex vivo-undersøgelser såsom celletype-specifikke genekspressions profilering og eventuel kortsigtet dyrkning for patch-clamp Elektrofysiologi målinger.
Figur 1 viser UNC-17:: gfp-positive kolinerge neuroner i der...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolering af specifikke neuron populationer fra rundorm Caenorhabditis elegans

Her præsenterer vi en protokol for enkel isolering af specifikke grupper af levende neuronal celler, der udtrykker grønt fluorescerende protein fra transgene Caenorhabditis elegans linjer. Denne metode muliggør en række ex vivo-undersøgelser med fokus på specifikke neuroner og har kapacitet til at isolere celler til yderligere kort tids dyrkning.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Denne protokol giver mulighed for problemfri isolation, dyrkning, og forhør af transskriptionelle svar i en bestemt celle afstamning fra C.elegans. Den største fordel ved denne protokol er den høje grad af tilpasningsevne til forskellige livsstadier af orme eller specifikke celletyper, der skal isoleres. Demonstration af proceduren vil være mig selv og Nataliya Zahayko, en tekniker fra vores laboratorium.Efter opsamling af dyrene centrifugeres de ved 1600 gange g i fem minutter. Fjern alle supernatant og resuspend ormene i en milliliter M9 medier. Suspensionen overføres til et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter.Centrifuge ved 1600 gange g i fem minutter for at pellet ormene. Derefter tilsættes 200 mikroliter SDS-DTT buffer og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Ormene skal nu synes at være rynket langs kroppen, hvis de ses under et lys mikroskop.Dernæst tilsættes 800 mikroliter iskold isolationsbuffer og blandes ved forsigtigt at svippe røret. Centrifuge ved 13,000 gange g og ved fire grader Celsius i et minut for at pellet ormene. Fjern supernatanten og vask med en milliliter isolationsbuffer.Gentag centrifugerings- og vaskeprocessen i alt fem gange, og sørg for forsigtigt at fjerne isolationsbufferen hver gang. Derefter tilsættes 100 mikroliter proteaseblanding fra Streptomyces griseus, opløst i isolationsbuffer, til pellet. Inkuber ved stuetemperatur i 10 til 15 minutter, og sørg for at anvende mekanisk afbrydelse ved pipettering op og ned 60 til 70 gange med en 200-mikroliter mikropipette spids mod bunden af røret.For at bestemme nedbrydningsstadiet skal du fjerne en til fem mikroliter af fordøjelsesblandingen, slippe den på et glasrutsjebane og inspicere den ved hjælp af et vævskulturmikroskop. Efter fem til syv minutter, orm fragmenter bør have en synligt reduceret neglebånd og en gylle af celler vil være let synlige. Standse reaktionen ved at tilføje 900 mikroliter af kommercielt tilgængelige Leibovitz's L-15 medium, suppleret med 10% FBS og penicillin-streptomycin.Centrifuge ved 10,000 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter til pellet isolerede fragmenter og celler. Vask de pelleterede celler to gange mere med kolde L-15 supplerede medier ved hjælp af en milliliter medier pr vask. Opslæm de pelleterede celler i en milliliter L-15 suppleret medier, og lad på is i 30 minutter.Derefter tage det øverste lag, som er ca 700 til 800 mikroliter, og overføre det til en mikrocentrifuge rør. Brug en automatiseret celletæller eller hemacytometer til at måle celletætheden på 10 til 25 mikroliter af isolerede celler. Centrifugeceller fra den isolerede cellesuspension ved 10.000 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter.Kassér supernatanten og opslæmp de pelleterede celler i L-15 suppleret medium til en celletæthed på højst seks millioner celler pr. milliliter for at undgå overbelastning af flowcytometeret. Sorter derefter celler efter GFP-positivt udtryk ved hjælp af et flowcytometer, der kan sortere prøver. GFP-negative celler kan bruges som kontrolelement til ikke-celletypespecifik analyse.Efter dette, plade de isolerede celler i brøndene i en steril seks-brønd plade, placere pladen i en plastbeholder, tilsæt en fugtig tørre eller blødt silkepapir for at tilføje fugt til cellerne, og inkubere ved 20 grader Celsius. Centrifugeceller fra den isolerede cellesuspension i et 1,5 milliliter RNase-frit mikrocentrifugerør ved 10,000 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Ved hjælp af en mikropipette skal du fjerne supernatanten og tilsætte 100 mikroliter M9-mediet for at vaske L-15-det supplerede medium væk.Dernæst centrifuge cellerne ved 10, 000 gange g og ved fire grader Celsius i fem minutter og fjern supernatanten. Gentag denne vask og centrifugering proces tre gange i alt for at sikre, at alle medier er fjernet, og sørg for omhyggeligt at fjerne supernatant hver gang. Derefter tilsættes en milliliter fenol og guanidin isothiocyanat opløsning til cellerne og pipette suspensionen op og ned omhyggeligt.Inkuber blandingen ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter tilsættes 250 mikroliter chloroform og let vendes røret 15 til 20 gange. Inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter.Centrifuge ved 10, 000 gange g og ved 25 grader Celsius i fem minutter. Brug en mikropipette til forsigtigt at fjerne så meget af det øverste vandige lag som muligt, og sørg for ikke at forstyrre de nederste organiske lag. Overfør det nederste lag til et nyt 1,5 milliliter RNase-frit mikrocentrifugerør.Til det nye rør tilsættes 500 mikroliter isopropanol og blandes ved at vende røret. Denne opløsning inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter centrifuge røret ved 14, 000 gange g og ved 25 grader Celsius i 20 minutter.Placer prøverne på is og bruge en mikropipette til at fjerne så meget isopropanol som muligt. Tilsæt forsigtigt en milliliter 70% ethanol i RNase-fri dobbeltdestilleret vand til røret ved at anvende det på siden af røret. Centrifuge ved 10, 000 gange g og ved 25 grader Celsius i fem minutter.Fjern det meste af ethanol og lad røret lufttørre på is i tre til fem minutter. Derefter tilsættes 15 til 20 mikroliter RNase-fri dobbeltdestilleret vand. Brug et spektrofotometer ved 260 nanometer til at måle RNA-koncentrationen og renheden.I denne undersøgelse udvindes og isoleres unc-17:GFP-positive kolinerge neuroner fra rundorm c.elegans til efterfølgende ex vivo-studier. Unc-17 genet udtrykkes i hele C.elegans kroppen, og koder for en vesicular acetylcholin transmembrane transportør. Udtrykket af dette gen kan observeres i hoved, midbody, og hale neuroner, og neuron fremskrivninger.Repræsentative fluorescens mikrografer af unc-17:GFP-positive neuroner efter isolation, samt en respektive negativ kontrol fra uændrede N2 vilde type dyr, er vist her. Isolerede celler kan holde sig i live op til tre dage, når suppleret med Leibovitz's L-15 medium og 10% FBS. Repræsentative data for qPCR fra GFP-udtrykkende kolinerge neuroner, samt GFP-udtryk muskelceller, er vist her.Efter vellykket sortering af celler isoleres RNA via en phenol- og guanidin isothiocyanatmetode, hvorefter cDNA blev produceret ved hjælp af et syntesesæt. Ekspression af kolinerge neuron-specifikke gener, tph-1, en tryptofan hydroxylase, og snb-1, en synaptisk vesicle transporter, er forhøjet i unc-17:GFP isolerede celler. Dette udtryk findes dog ikke i isoleret celler i myo-3:GFP.Det modsatte er sandt med udtrykket af den muskel-specifikke myosin-tunge kæde udskrift af myo-2, som udtryk for dette gen er begrænset til isolerede muskelceller, men ikke de isolerede kolinerge celler. Det er vigtigt at inkubere ormene fuldt ud. Men, udvidet inkubation af ormen kutel kan resultere i orm død eller yderligere stress til dyret.Efter isoleringen kan cellerne enten dyrkes i en periode eller anvendes til RNA-isolation og qRT-PCR-analyse. Dyrkede neuroner kan analyseres yderligere ved patch clamp elektroforese målinger. Denne teknik kan lette ex vivo-analyse af specifikke grupper af celler og dermed bidrage til at forbedre vores forståelse af cellespecifikke reaktioner i forbindelse med flercellede organismer på forskellige stadier af dens livscyklus.Da kemikalier som SDS og DTT anvendes under dette eksperiment, bør generelle laboratoriesikkerhedsprocedurer følges, mens du laver og bruger buffere.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering af Perivaskulær multipotente precursorcelle populationer fra humant hjertevæv

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering af Functional Islets fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdering af lysosomale basisk i tarmen af Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

At studere Oxidative Stress forårsaget af Mitis gruppe streptokokker i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Måling sperm vejledning og motilitet i Caenorhabditis elegans hermaphrodite reproduktive tarmkanalen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...