Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

We danken Dr. Jennifer Fox en de leden van het Khalimonchuk laboratorium voor inzichtelijke commentaren. We erkennen de steun van de National Institutes of Health (R01 GM108975 tot O.K. en T32 GM107001-01A1 tot E.M.G.).

1. voorbereiding en verzameling van oude wormen voor celisolatie
Opmerking: hieronder wordt uitgelegd is de isolatie van cholinerge neuronen van de transgene UNC-17:: GFP stam (OH13083) verkregen uit de Caenorhabditis genetica Center (CGC) stam repository aan de Universiteit van Minnesota. Het is noodzakelijk om steriele omstandigheden te handhaven om besmetting van schimmels of bacteriën te voorkomen.
<ol><li>Bereid en synchroniseer wormen via de bleken methode zoals besc...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

De rondworm C. elegans is een gevestigde en krachtige model voor het bestuderen van de neuronale gezondheid en ziekte2. Met ruime genetische hulpmiddelen om deze dieren te manipuleren en beheersbare hoeveelheid nauwkeurig in kaart gebrachte neuron types, kan een groot deel van de gegevens worden verzameld met een relatief kleine hoeveelheid materiaal. Hier schetsen we een geoptimaliseerde methode om verschillende neuronen van hele dieren te isoleren. Door de buitenste cuticula-eiwitten va...

In de afgelopen decennia, het metazoan modelorganisme Caenorhabditis elegans is een enorme troef in de studie van neuronen, neuronale circuits en haar rol in fysiologische en gedragsmatige reacties, en veroudering-geassocieerde neurodegeneratieve Ziekten. Een unieke eigenschap van C. elegans is dat de dieren transparant zijn, waardoor de afstamming van alle volwassen somatische cellen in kaart kan worden gebracht1. C. elegans herbergt ook beheersbare hoeveelheid neuronen, wat leidt tot de morfologie en connectiviteit van het zenuwstelsel wordt goed begrepen2. De invariante celafstamming, korte levensduur en overvloed aan genetische hulpmiddelen met hoge doorvoer die beschikbaar zijn voor C. elegans maken het een ideaal modelorganisme voor de studie van veroudering binnen verschillende neuronale populaties.
Veroudering van neuronen en neurodegeneratieve aandoeningen zijn complex, en elke stoornis heeft unieke pathologische handtekeningen die ermee verbonden zijn. Echter, voor veel van deze aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson en Alzheimer, een gemeenschappelijk kenmerk is de progressieve belasting van verkeerd gevouwen eiwitten3,4,5. In beide van deze ziekten, eiwitten misvouwen en aggregaat binnen de cel om toxiciteit te veroorzaken, uiteindelijk leiden tot celdood4,5. Voor de juiste veroudering van neuronen, de homeostase van de mitochondriën, meer specifiek eiwit homeostase, is belangrijk, als verstoringen en dyshomeostase kan leiden tot neurodegeneratie6,7,8. Cellen zijn uitgerust met verschillende mechanismen om eiwit homeostase te handhaven, één is de ongevouwen eiwit respons (UPR) ― een klassieke route waarbij signalen van endoplasmisch reticulum (ER) intracellulaire signaal Cascades activeren, wat leidt tot een transcriptionele Response9. Verwant aan deze UPRer, figuur vertonen een soortgelijke reactie op het verlies van mitochondriale eiwit homeostase, de zogenaamde mitochondriale UPR (UPRMT)7,8. C. elegans lijkt het meest basale organisme te zijn dat een bevestigde en goed gedefinieerde UPRMT traject7heeft.
De functie/disfunctie van specifieke neuronale populaties binnen een groter netwerk kan moeilijk te beoordelen zijn vanwege hun intrinsieke connectiviteit en complexiteit3. Echter, er is vaak een behoefte om te bestuderen van verschillende neuronale populaties als gevolg van celtypespecifieke ziekten met complexe pathologieën, zoals die in verband met verminderde cellulaire eiwit homeostase. In C. eleganskunnen specifieke neuronale populaties genetisch gemanipuleerd worden, waardoor faciele observatie in vivo mogelijk is. Het zenuwstelsel van C. elegans bestaat voornamelijk uit neuronen, met een klein percentage gliacellen. Bij volwassen hermafrodiet wormen zijn er ongeveer 302 neuronen, onderverdeeld in meer dan 100 verschillende klassen2,10. Neuronen zoals cholinerge neuronen overheersingen in neuromusculaire knooppunten, terwijl Dopaminerge neuronen voornamelijk betrokken zijn bij sensatie10,11. Aangezien zowel motorische activiteit als zintuiglijke vaardigheden afnemen met de leeftijd, is het belangrijk om mechanistische inzichten over defecten in deze individuele neuronen te detail te bekijken11,12. Als zodanig is er behoefte aan een eenvoudige en robuuste methode om intacte cellen van belang te isoleren voor latere ex vivo-studies.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde effectieve methode voor de snelle isolatie van specifieke neuronale cellen die groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken uit C. elegans. Deze isolatiemethode kan worden uitgevoerd op larvale, juveniele of volwassen wormen. Isolatie van cellen van larvale Worms werd eerder gepubliceerd door Zhang et al.13 en zal hier niet worden besproken. Een belangrijke opmerking hier is dat alle wormen in dezelfde levensfase moeten zijn om overmatige vertering van het dier of besmetting van dieren in verschillende levensstadia te voorkomen. Door zowel enzymatische als mechanische verstoring van de nematode cuticula, een exoskelet hoog in collageen en andere structurele eiwitten, kan een grote verscheidenheid aan cellen worden geïsoleerd13,14. Cellen kunnen vervolgens worden geïsoleerd via Flowcytometrie of antilichaam gelabelde magnetische kralen. Typisch, RNA is geïsoleerd via een fenol en guanidine isothiocyanaat methode om te zorgen voor de verrijking van de gewenste celpopulatie15. Met veel zorg kunnen deze geïsoleerde cellen worden gehandhaafd in een kweek kolf of multi-well gerecht. Deze methode vertegenwoordigt een unieke en krachtige tool in de studie van specifieke neuronen en heeft de capaciteit om te isoleren van levende en functionele cellen voor verdere culturing.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Tijdens het verouderingsproces, veel cellen accumuleren hoge niveaus van schade die leidt tot cellulaire dysfunctie, die ten grondslag ligt aan vele geriatrische en pathologische omstandigheden. Post-mitotische neuronen vertegenwoordigen een belangrijk celtype beïnvloed door veroudering. Hoewel meerdere zoogdieren modellen van neuronale veroudering bestaan, ze zijn uitdagend en duur om vast te stellen. De rondworm Caenorhabditis elegans is een krachtig model om neuronale veroudering te bestuderen, omdat deze dieren een korte levensduur hebben, een beschikbare robuuste genetische Toolbox en goed gecatalogeerd zenuwstelsel. De hier gepresenteerde methode zorgt voor naadloze isolatie van specifieke cellen op basis van de uitdrukking van een transgene groene fluorescerende proteïne (GFP). Transgene dieren lijnen die GFP uitdrukken onder verschillende celtypespecifieke promotors worden verteerd om de buitenste cuticula te verwijderen en zachtjes mechanisch verstoord om slurry met verschillende celtypen te produceren. De cellen van belang worden vervolgens gescheiden van niet-doelcellen via fluorescentie-geactiveerde celsortering, of door anti-GFP-gekoppelde magnetische kralen. De geïsoleerde cellen kunnen vervolgens voor een beperkte tijd worden gekweekt of onmiddellijk worden gebruikt voor cel-specifieke ex vivo-analyses, zoals transcriptionele analyse door real-time kwantitatieve PCR. Dit protocol zorgt dus voor een snelle en robuuste analyse van celspecifieke reacties binnen verschillende neuronale populaties in C. elegans.

Het hier beschreven protocol zorgt voor specifieke isolatie van UNC-17:: GFP-positieve cholinerge neuronen van de rondworm C. elegans voor latere ex vivo studies zoals celtypespecifieke genexpressie profilering en uiteindelijke kortdurende kweek voor Patch-clamp elektrofysiologie metingen.
Figuur 1 toont UNC-17:: GFP-positieve cholinerge neuronen in hun normale instelling....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Dit protocol zorgt voor de naadloze isolatie, culturing, en ondervraging van transcriptie reacties in een specifieke cel lijn van C.elegans. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het hoge niveau van aanpassingsvermogen aan verschillende levensfasen van wormen of specifieke celtypen die moeten worden geïsoleerd. Het aantonen van de procedure zal ik zijn en Nataliya Zahayko, een technicus uit ons laboratorium.Na het verzamelen van de dieren, centrifugeren ze op 1600 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder alle supernatant en resuspend de wormen in een milliliter van M9 media. Breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Centrifuge op 1600 keer g gedurende vijf minuten om de wormen pellet. Voeg vervolgens 200 microliter SDS-DTT buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. De wormen moeten nu lijken te zijn gerimpeld langs het lichaam als bekeken onder een lichte microscoop.Voeg vervolgens 800 microliters van ijskoude isolatiebuffer toe en meng door zachtjes met de buis te vegen. Centrifuge op 13.000 keer g en bij vier graden Celsius gedurende een minuut om de wormen te pelleteren. Verwijder de supernatant en was met een milliliter isolatiebuffer.Herhaal het centrifugatie- en wasproces in totaal vijf keer, zodat u de isolatiebuffer telkens zorgvuldig verwijdert. Voeg hierna 100 microliter proteasemengsel van Streptomyces griseus, opgelost in isolatiebuffer, toe aan de pellet. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten, zorg ervoor dat mechanische verstoring toe te passen door pipetten op en neer 60 tot 70 keer met een 200-microliter micropipet tip tegen de onderkant van de buis.Om het stadium van de spijsvertering te bepalen, verwijder een tot vijf microliters van het spijsverteringsmengsel, laat het op een glazen glijbaan vallen en inspecteer het met behulp van een weefselkweekmicroscoop. Na vijf tot zeven minuten moeten wormfragmenten een zichtbaar verminderde cuticula hebben en een drijfmest van cellen zal gemakkelijk zichtbaar zijn. Stop de reactie door 900 microliters van commercieel verkrijgbare Leibovitz's L-15 medium toe te voegen, aangevuld met 10%FBS en penicilline-streptomycine.Centrifuge op 10.000 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten om geïsoleerde fragmenten en cellen te pelleteren. Was de pelleted cellen twee keer meer met koude L-15 aangevuld media met behulp van een milliliter van de media per wasbeurt. Resuspend de pelleted cellen in een milliliter van L-15 aangevuld media, en laat op ijs gedurende 30 minuten.Neem vervolgens de bovenste laag, die ongeveer 700 tot 800 microliters is, en breng deze over naar een microcentrifugebuis. Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemacytometer om de celdichtheid van 10 tot 25 microliter van geïsoleerde cellen te meten. Centrifugecellen uit de geïsoleerde celsuspensie bij 10.000 keer g en vijf minuten bij vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg en stel de gepelde cellen in L-15-aangevuld medium opnieuw op tot een celdichtheid van niet meer dan zes miljoen cellen per milliliter om overbelasting van de stroomcytometer te voorkomen. Sorteer vervolgens cellen op GFP-positieve expressie met behulp van een stroomcytometer die monsters kan sorteren. GFP-negatieve cellen kunnen worden gebruikt als een controle voor niet-cel-type-specifieke analyse.Na deze, plaat de geïsoleerde cellen in de putten van een steriele zes-put plaat, plaats de plaat in een plastic container, voeg een vochtige doekje of zacht weefsel papier om vocht toe te voegen aan de cellen, en uitbroeden op 20 graden Celsius. Centrifugecellen uit de geïsoleerde celsuspensie in een 1,5 milliliter RNase-vrije microcentrifugebuis bij 10.000 keer g en vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder met behulp van een micropipet het supernatant en voeg 100 microliter M9-medium toe om het L-15-medium weg te wassen.Vervolgens centrifugeren de cellen op 10,000 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder de supernatant. Herhaal dit was- en centrifugatieproces drie keer in totaal om ervoor te zorgen dat alle media worden verwijderd, om ervoor te zorgen dat de supernatant elke keer zorgvuldig wordt verwijderd. Voeg vervolgens een milliliter fenol en guanidine isothiocyanaat oplossing aan de cellen en pipette de suspensie op en neer zorgvuldig.Broed het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg hierna 250 microliter chloroform toe en draai de buis voorzichtig 15 tot 20 keer om. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden.Centrifuge op 10.000 keer g en bij 25 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een micropipet om zorgvuldig te verwijderen zo veel van de bovenste waterige laag mogelijk, zorg ervoor dat de onderste organische lagen niet verstoren. Breng de onderste laag over op een nieuwe 1,5 milliliter RNase-vrije microcentrifugebuis.Voeg aan de nieuwe buis 500 microliter isopropanol toe en meng door de buis om te keren. Broed deze oplossing vijf minuten lang op kamertemperatuur uit. Vercentrifugeren de buis vervolgens op 14.000 keer g en 25 graden Celsius gedurende 20 minuten.Plaats de monsters op ijs en gebruik een micropipet om zoveel mogelijk isopropanol te verwijderen. Voeg voorzichtig een milliliter van 70% ethanol in RNase-vrij dubbelgedestilleerd water aan de buis door het aan te brengen op de zijkant van de buis. Centrifuge op 10.000 keer g en bij 25 graden Celsius gedurende vijf minuten.Verwijder het grootste deel van de ethanol en laat de buis drie tot vijf minuten drogen op ijs. Voeg hierna 15 tot 20 microliter RNase-vrij dubbelgedestilleerd water toe. Gebruik een spectrofotometer op 260 nanometer om de RNA-concentratie en zuiverheid te meten.In deze studie worden unc-17:GFP-positieve cholinerge neuronen geëxtraheerd en geïsoleerd uit de rondworm C.elegans voor latere ex vivo-studies. Het unc-17 gen wordt uitgedrukt in het hele lichaam van de C.elegans, en codes voor een vesiculaire acetylcholine transmembrane transporter. De expressie van dit gen kan worden waargenomen in hoofd, midbody, en staart neuronen, en neuron projecties.Representatieve fluorescentiemicrografen van unc-17:GFP-positieve neuronen na isolatie, evenals een respectieve negatieve controle van ongewijzigde N2 wilde type dieren, worden hier getoond. Geïsoleerde cellen kunnen tot drie dagen in leven blijven wanneer ze worden aangevuld met Leibovitz's L-15 medium en 10%FBS. Representatieve gegevens van qPCR van GFP-uitdrukkende cholinerge neuronen, evenals GFP-uitdrukkende spiercellen, wordt hier getoond.Na het succesvol sorteren van cellen wordt RNA geïsoleerd via een fenol- en guanidine isothiocyanaatmethode, waarna cDNA werd geproduceerd met behulp van een synthesekit. Expressie van cholinerge neuron-specifieke genen, tph-1, een tryptofaan hydroxylase, en snb-1, een synaptische vesicle transporter, is verhoogd in unc-17:GFP geïsoleerde cellen. Deze expressie is echter niet aanwezig in myo-3:GFP geïsoleerde cellen.Het omgekeerde is waar met de expressie van de spierspecifieke myosine-zware kettingtranscriptie van myo-2, omdat de expressie van dit gen beperkt is tot geïsoleerde spiercellen, maar niet tot de geïsoleerde cholinerge cellen. Het is belangrijk om de wormen volledig uit te broeden. Uitgebreide incubatie van de wormschuin kan echter leiden tot wormdood of extra stress voor het dier.Na de isolatie kunnen de cellen gedurende een bepaalde periode worden gekweekt of worden gebruikt voor RNA-isolatie en qRT-PCR-analyse. Gekweekte neuronen kunnen verder worden geanalyseerd door patch klem elektroforese metingen. Deze techniek kan de analyse van specifieke groepen cellen vergemakkelijken, waardoor ons begrip van celspecifieke reacties in de context van meercellige organismen in verschillende stadia van de levenscyclus wordt verbeterd.Aangezien chemische stoffen zoals SDS en DTT worden gebruikt tijdens dit experiment, moeten algemene laboratoriumveiligheidsprocedures worden gevolgd tijdens het maken en gebruiken van buffers.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studeren oxidatieve Stress veroorzaakt door de streptokokken groep Mitis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...