Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

אנו מודים לד ר ג'ניפר פוקס ולחברי מעבדת ח'אימונצ'וק להערות תובנה. אנו מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (R01 GM108975 כדי בסדר ו T32 GM107001-01A1 ל E.M.G.).

1. הכנה ואיסוף של תולעים בגילאי לבידוד תאים
הערה: הסבר להלן הוא הבידוד של נוירונים cholinergic מן הטרנסגניים unc-17:: מאמץ GFP (OH13083) שהתקבלו מן המרכז הגנטי caenorהאבודיטיס (cgc) מאגר המתח באוניברסיטת מינסוטה. זה הכרחי לשמור על התנאים סטרילי כדי למנוע זיהום של פטריות או חיידקים.
<ol>...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

מודל התולעים העגולות הוא דגם מבוסס ועוצמתי לחקר בריאות ומחלות עצביים2. עם כלים גנטיים בשפע כדי לתמרן בעלי חיים אלה וכמות לניהול של סוגים שונים של נוירונים ממופה בדיוק, מידע רב ניתן לאסוף עם כמות קטנה יחסית של חומר. כאן, אנו מתווה שיטה ממוטבת כדי לבודד נוירונים שונים מחיות ?...

במהלך העשורים האחרונים, האורגניזם המודל החדש Caenorהאבודיטיס מודל היה נכס עצום בחקר הנוירונים, המעגלים העצביים ותפקידה בתגובות פיסיולוגיים והתנהגותיים, והזדקנות הקשורים נוירוניווניות חלות. התכונה הייחודית של הג היא שבעלי החיים שקופים, ומאפשרים שושלת היוחסין של כל התאים הסומאטיים הבוגרים להיות ממופים1. ג. אלגיה מקיימת גם כמות של נוירונים, המובילה לתחום המבנה והקישוריות של מערכת העצבים שהבינה היטב2. השושלת הקבועה של התאים, תוחלת החיים הקצרה והשפע של כלים גנטיים בתפוקה גבוהה הזמינות עבור C. אלגיה הופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההזדקנות בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות.
הזדקנות הנוירונים והפרעות ניווניות הן מורכבות, וכל הפרעה יש חתימות פתולוגיים ייחודי הקשורים בו. עם זאת, עבור רבים מהפרעות אלה, כגון מחלת פרקינסון ואלצהיימר, תכונה נפוצה היא העומס הפרוגרסיבי של חלבונים misfolded3,4,5. בשתי מחלות אלה, חלבונים misfold לצבור בתוך התא כדי לגרום לרעילות, בסופו של דבר המוביל למוות התאים4,5. עבור הזדקנות נאותה של נוירונים, הומאוסטזיס של המיטומטר, יותר במיוחד הומאוסטזיס חלבון, חשוב, כמו רטבאליות ו dyshomeoאוסטזיס יכול להוביל נוירוניוון6,7,8. תאים מצוידים מנגנונים שונים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון, אחד להיות תגובת חלבון שפרש (upr) – מסלול קלאסי שבו אותות מן הרשתית רשתית פלזמית (ER) להפעיל אות תאיים מפלי, המוביל להמרה . תשובה9 לאורזה, מטזואים להציג תגובה דומה אובדן של הומאוסטזיס חלבון מיטוכונדריאלי, המכונה כביכול upr (uprmt)7,8. ג. אלגיה נראה האורגניזם הבזלי ביותר להיות מאומת ומוגדר היטב מסלולהר 7.
פונקציה/תפקוד של אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות בתוך רשת גדולה יותר יכול להיות קשה להעריך בשל הקישוריות הפנימית שלהם ואת המורכבות3. עם זאת, יש לעיתים קרובות צורך ללמוד אוכלוסיות עצביים נפרדות בשל סוג תא מחלות ספציפיות עם פתווגיות מורכבות, כמו אלה הקשורים עם לקויי חלבון הומאוסטזיס הסלולר. בתוך C. אלאנים, אוכלוסיות נוירואליות מסוימות יכולות להיות מניפולציות גנטית המאפשרות התבוננות נתיישב בvivo. מערכת העצבים של C. אלגיה מורכבת בעיקר מנוירונים, עם אחוז קטן של תאים גליאל. ב תולעים דו-מיניים למבוגרים, ישנם כ 302 נוירונים, מחולק למעל 100 כיתות שונות2,10. נוירונים כגון cholinergic נוירונים להשתלט על הצמתים נוירוסקולריות, בעוד נוירונים דואמנרגיים מעורבים בעיקר תחושה10,11. כאשר הן פעילות מוטורית והן יכולות חישה לירידה עם הגיל, חשוב לפרט תובנות מכניסטיות על פגמים בנוירונים בודדים אלה11,12. ככזה, יש צורך בשיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד תאים שלמים של עניין למחקרים הבאים vivo ex.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה ממוטבת לבידוד מהיר של תאים עצביים ספציפיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מ -C. אלגיה. ניתן לבצע שיטת בידוד זו על תולעים, לקטינים או למבוגרים. בידוד של תאים מתולעי זחל פורסם בעבר על ידי ג'אנג ואח '13 ולא יידונו כאן. הערה חשובה כאן היא שכל התולעים צריכות להיות באותו שלב של החיים כדי למנוע העיכול של בעל החיים או זיהום מבעלי חיים בשלבי חיים שונים. באמצעות שיבושים אנזימטי ומכני של הקוטיקולה נמטודות, הגבוהה שלד חיצוני קולגן וחלבונים מבניים אחרים, מגוון רחב של תאים יכול להיות מבודד13,14. תאים לאחר מכן יכול להיות מבודד באמצעות cy, הזרמת לנסות או נוגדנים המסומנים חרוזים מגנטיים. בדרך כלל, רנ א מבודד באמצעות פנול ו guanidine isothiyanate שיטה כדי להבטיח את העשרת האוכלוסיה הרצויה של התאים15. עם טיפול הרבה תאים אלה מבודדים ניתן לשמור בבקבוקון תרבות או מרובת היטב צלחת. שיטה זו מייצגת כלי ייחודי ורב עוצמה במחקר של נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים חיים פונקציונלי עבור culturing נוספת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

במהלך תהליך ההזדקנות, תאים רבים מצטברים רמות גבוהות של נזק המוביל לתפקוד לקוי של הסלולר, אשר ביסוד הרבה מצבים גריאטרי ופתולוגי. הנוירונים פוסט-mitotic מייצגים סוג תא ראשי המושפע על ידי הזדקנות. למרות שדגמים מרובים של הזדקנות עצבית קיימים, הם מאתגרים ויקרים להקמת. האלגיה העגולה של התולעים העגולות היא מודל רב-עוצמה לחקר הזדקנות עצבית, מאחר שלחיות אלה יש תוחלת חיים קצרה, כתיבת כלים גנטית חזקה ומערכת עצבים מקוטלקת היטב. השיטה המוצגת בזאת מאפשרת בידוד חלק של תאים ספציפיים בהתבסס על הביטוי של חלבון פלורסנט ירוק טרנסגניים (GFP). קווי בעלי חיים טרנסגניים המבטא GFP תחת נבדל, סוג תא ספציפי היזמים מתעכלים כדי להסיר את הקוטיקולה החיצונית בעדינות שיבש מכני כדי לייצר שובלים המכילים סוגי תאים שונים. תאי העניין מופרדים לאחר מכן מתאים שאינם יעד באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות פלואורסצנטית, או באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-GFP בשילוב. התאים המבודדים לאחר מכן יכול להיות מתורבת לזמן מוגבל או באופן מיידי משמש לניתוח ספציפי לתא לשעבר vivo כגון ניתוח ההמרה על ידי PCR בזמן אמת כמותי. לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר ויציב של תגובות לתאים ספציפיים בתוך אוכלוסיות נוירואליות שונות בג.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בידוד ספציפי של unc-17:: gfp-חיוביות cholinergic הנוירונים מתוך C. אלגיה עבור מחקרים עתידיים לשעבר vivo כגון סוג תא ספציפי ביטוי גנים פרופיל ובסופו של דבר למידה קצרת-טווח למדידות מהדק-אלקטרופיזיולוגיה.
...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד פשוט של קבוצות מסוימות של תאים עצביים חיים המבטא חלבון פלורסנט ירוק מקווי האלגניים של הקווים. שיטה זו מאפשרת מגוון של מחקרים vivo ex התמקדו נוירונים ספציפיים ויש לו את היכולת לבודד תאים עבור לטווח קצר יותר culturing.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

פרוטוקול זה מאפשר בידוד חלק, culturing, וחקירה של תגובות שעתוק בשושלת תאים ספציפית מ C.elegans. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הרמה הגבוהה של הסתגלות לשלבי חיים שונים של תולעים או סוגי תאים ספציפיים שיש לבודד. להדגים את ההליך יהיו אני ונטליה זאהיקו, טכנאית מהמעבדה שלנו.לאחר איסוף בעלי החיים, צנטריפוגה אותם ב 1600 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את כל supernatant ו resuspend התולעים במיליליטר אחד של מדיה M9. העבר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה ב 1600 פעמים g במשך חמש דקות כדי גלולה התולעים. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ SDS-DTT ודגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. התולעים אמורות להיראות כעת מקומטות לאורך הגוף אם רואים אותן תחת מיקרוסקופ אור.לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ בידוד קר כקרח וערבבו על ידי החלקה עדין של הצינור. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת כדי גלולה התולעים. הסר את העל-טבעי ושטף עם מיליליטר אחד של חיץ בידוד.חזור על תהליך הצנטריפוגה והכביסה בסך הכל חמש פעמים, הקפד להסיר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus, מומס במאגר בידוד, לכדור. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות, הקפד להחיל שיבושים מכניים על ידי צינור למעלה ולמטה 60 עד 70 פעמים עם קצה micropipette 200 מיקרוליטר נגד החלק התחתון של הצינור.כדי לקבוע את שלב העיכול, הסר אחד עד חמישה microliters של תערובת העיכול, להפיל אותו על מגלשת זכוכית, ולבדוק אותו באמצעות מיקרוסקופ תרבות רקמות. לאחר חמש עד שבע דקות, שברי תולעת צריכים להיות קוטיקל מופחת בעליל ותרסיס של תאים יהיה גלוי בקלות. עצרו את התגובה על ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של מדיום L-15 של ליבוביץ' הזמין מסחרית, בתוספת 10% FBS ופניצילין-סטרפטומיצין.צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה שברים ותאים מבודדים. לשטוף את התאים גלולה פעמיים יותר עם מדיה קרה L-15 בתוספת באמצעות מיליליטר אחד של מדיה לכל לשטוף. תן שימוש חוזר בתאים גלולה במיליליטר אחד של L-15 בתוספת מדיה, ולהשאיר על הקרח במשך 30 דקות.לאחר מכן קחו את השכבה העליונה, שהיא כ-700 עד 800 מיקרוליטרים, והעבירו אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemacytometer כדי למדוד את צפיפות התא של 10 עד 25 microliters של תאים מבודדים. תאי צנטריפוגה מהתלייה התא המבודדת ב 10, 000 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים המוגלתיים ב-L-15 בתוספת בינונית לצפיפות תאים של לא יותר משישה מיליון תאים למיליליטר כדי למנוע עומס יתר על ציטרומטר הזרימה. לאחר מכן, מיין תאים לפי ביטוי GFP חיובי באמצעות ציטומטר זרימה המסוגל למיין דגימות. תאים שליליים מסוג GFP יכולים לשמש כפקד לניתוח שאינו ספציפי לסוג התא.לאחר מכן, צלחת התאים המבודדים לתוך בארות של צלחת סטרילית שש באר, למקם את הצלחת לתוך מיכל פלסטיק, להוסיף לנגב לח או נייר רקמה רכה כדי להוסיף לחות לתאים, דגירה ב 20 מעלות צלזיוס. תאי צנטריפוגה מהשעיית התא המבודד בצינור מיקרוצנטריפוגה נטול RNase ב-10,000 פעמים גר' וב-4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. באמצעות micropipette, להסיר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של מדיום M9 לשטוף את המדיום בתוספת L-15.לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 10, 000 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant. חזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה שלוש פעמים בסך הכל כדי להבטיח כי כל המדיה מוסרת, הקפד להסיר בזהירות את supernatant בכל פעם. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של פנול וגואנידין isothiocyanate פתרון לתאים פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה בזהירות.להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של כלורופורם בעדינות להפוך את הצינור 15 עד 20 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש micropipette כדי להסיר בזהירות כמה שיותר של השכבה המים העליון ככל האפשר, הקפדה לא להפריע את השכבות האורגניות התחתונות. מעבירים את השכבה התחתונה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase באורך 1.5 מיליליטר.לצינור החדש, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של isopropanol ומערבבים על ידי היפוך הצינור. הדגירה פתרון זה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. ואז צנטריפוגה הצינור ב 14, 000 פעמים גרם וב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.מניחים את הדגימות על קרח ולהשתמש micropipette כדי להסיר כמה שיותר isopropanol ככל האפשר. הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של 70% אתנול במים מזוקקים כפולים נטולי RNase לצינור על ידי החלתו על צד הצינור. צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.מוציאים את רוב האתנול ותנו לצינור להתייבש על הקרח למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 15 עד 20 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים ללא RNase. השתמש ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר כדי למדוד את ריכוז RNA וטוהר.במחקר זה, unc-17:GFP חיובי נוירונים כולין מופקים ומבודדים מן התולעת העגולה C.elegans למחקרים לשעבר vivo הבאים. הגן unc-17 בא לידי ביטוי בכל הגוף C.elegans, וקודים עבור טרנספורטר transmembrane אצטילכולין כלי דם. הביטוי של גן זה ניתן לראות בראש, midbody, נוירונים זנב, תחזיות נוירון.מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מייצגים של נוירונים לא חיוביים של UNC-17:GFP לאחר הבידוד, כמו גם שליטה שלילית בהתאמה מבעלי חיים מסוג N2 ללא שינוי, מוצגים כאן. תאים מבודדים יכולים להישאר בחיים עד שלושה ימים כאשר בתוספת L-15 בינוני של ליבוביץ ו 10%FBS. נתונים מייצגים של qPCR מ GFP-ביטוי נוירונים כולין, כמו גם GFP-ביטוי תאי שריר, מוצג כאן.לאחר מיון מוצלח של תאים, RNA מבודד באמצעות שיטת פנול וגואנידין איזותיוצ'יאנט, שלאחריה יוצרה cDNA באמצעות ערכת סינתזה. ביטוי של גנים ספציפיים נוירון כולין, tph-1, hydroxylase טריפטופן, ו snb-1, טרנספורטר וקסילי סינפטי, מוגבה בתאים מבודדים unc-17:GFP. עם זאת, ביטוי זה אינו קיים בתאים מבודדים myo-3:GFP.ההופכי נכון עם הביטוי של תעתיק שרשרת מיוסין-כבד ספציפי לשריר של myo-2, כמו הביטוי של גן זה מוגבל לתאי שריר מבודדים, אבל לא תאים כולין מבודדים. חשוב לה הדגירה את התולעים באופן מלא. עם זאת, דגירה ממושכת של קוטיקל התולעת עלולה לגרום למוות של תולעת או ללחץ נוסף על החיה.לאחר הבידוד, התאים יכולים להיות מתורבתים לתקופה של זמן, או לשמש לבידוד RNA וניתוח qRT-PCR. נוירונים מתורבתים ניתן לנתח עוד יותר על ידי מדידות אלקטרופורזה מהדק תיקון. טכניקה זו עשויה להקל על ניתוח אקס ויוו של קבוצות ספציפיות של תאים, ובכך לסייע בשיפור ההבנה שלנו של תגובות ספציפיות לתא בהקשר של אורגניזמים רב תאיים בשלבים שונים של מחזור החיים שלה.כמו כימיקלים כגון SDS ו DTT משמשים במהלך ניסוי זה, נהלי בטיחות מעבדה כללית יש לבצע בעת ביצוע ושימוש מאגרים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...