Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

हम डॉ जेनिफर फॉक्स और व्यावहारिक टिप्पणी के लिए Khalimonchuk प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. हम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 GM108975 से O.K. और T32 GM107001-01A1 से ई.एम.जी.) से समर्थन स्वीकार करते हैं।

1. सेल अलगाव के लिए वृद्ध कीड़े की तैयारी और संग्रह
नोट: नीचे समझाया ट्रांसजेनिक unc-17से कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव है ::GFP तनाव (OH13083) मिनेसोटा विश्वविद्यालय में Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर (CGC) त?...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

राउंडवार्म सी एलिगन न्यूरोनल स्वास्थ्य और रोग2का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और शक्तिशाली मॉडल है। पर्याप्त आनुवंशिक उपकरण ों में हेरफेर करने के लिए इन जानवरों और ठीक मैप व?...

पिछले कई दशकों में, metazoan मॉडल जीव Caenorhabditis elegans न्यूरॉन्स के अध्ययन में एक जबरदस्त संपत्ति रहा है, न्यूरॉन circuitry और शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं में अपनी भूमिका, और उम्र बढ़ने से जुड़े neurodegenerative रोगों. सी elegans की एक अनूठी विशेषता यह है कि जानवरों पारदर्शी हैं, सभी वयस्क कायिक कोशिकाओं के वंश के लिए अनुमति 1मैपकिया जा करने के लिए. C. elegans भी न्यूरॉन्स के प्रबंधनीय मात्रा बंदरगाह, आकृति विज्ञान और तंत्रिका तंत्र की कनेक्टिविटी के लिए अग्रणी अच्छी तरह से समझा जा रहा है2. निश्चर कोशिका वंश, कम उम्र, और उच्च throughput आनुवंशिक सी elegans के लिए उपलब्ध उपकरणों की बहुतायत यह अलग न्यूरॉन आबादी के भीतर उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बनाते हैं.
न्यूरॉन्स और neurodegenerative विकारों की उम्र बढ़ने जटिल हैं, और प्रत्येक विकार इसके साथ जुड़े अद्वितीय रोग हस्ताक्षर है. हालांकि, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग जैसे कई विकारों के लिए, एक आम विशेषता गलत तरीके से प्रोटीन3,4,5का प्रगतिशील भार है। इन दोनों रोगों में प्रोटीन गलत गुना और कोशिका के भीतर मिलाकर विषाक्तता पैदा करते हैं, जिससे अंततः कोशिका मृत्यु4,5हो जाती है। न्यूरॉन्स की उचित उम्र बढ़ने के लिए, mitochondria के homeostasis, अधिक विशेष रूप से प्रोटीन homeostasis, महत्वपूर्ण है, के रूप में क्षोभ और dyshomeostasis neurodegeneration के लिए नेतृत्व कर सकते हैं6,7,8. कोशिकाओं प्रोटीन homeostasis बनाए रखने के लिए विभिन्न तंत्र से लैस कर रहे हैं, एक सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया जा रहा है (UPR)-एक शास्त्रीय मार्ग जहां endoplasmic reticulum से संकेत (ईआर) intracellular संकेत cascades सक्रिय, एक प्रतिलिपि बनाने के लिए अग्रणी प्रतिक्रिया9| इस UPRईआरके समान , मेटाज़ोअनमाइटोकिनल प्रोटीन होमोस्टेसिस के नुकसान के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं , तथाकथित माइटोकोंड्रियाल यूपीआर (यूपीआरएमटी)7,8. C. elegans सबसे बेसल जीव के लिए एक पुष्टि की और अच्छी तरह से परिभाषित UPRमीटर मार्ग7है प्रतीत होता है.
एक बड़े नेटवर्क के भीतर विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के कार्य/रोग का आकलन उनकी आंतरिक कनेक्टिविटी और जटिलता3के कारण करना मुश्किल हो सकता है. हालांकि, अक्सर जटिल रोगों के साथ सेल प्रकार-विशिष्ट रोगों के कारण अलग न्यूरोनल आबादी का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि बिगड़ा सेलुलर प्रोटीन होमियोस्टेसिस से जुड़े लोग। सी elegansमें, विशिष्ट न्यूरॉन आबादी आनुवंशिक रूप से विवो में सुगम अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए हेरफेर किया जा सकता है. सी elegans के तंत्रिका तंत्र मुख्य रूप से न्यूरॉन्स के होते हैं, glial कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत के साथ. वयस्क हर्मोफ्रोडाइट कीड़े में लगभग 302 न्यूरॉन्स होते हैं, जो 100 से अधिक विभिन्न वर्गों2,10में विभाजित होते हैं . कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स जैसे न्यूरोन न्यूरोमस्क्युलर जंक्शनों में प्रबल होते हैं, जबकि डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स मुख्य रूप से सनसनी10,11में शामिल होते हैं। के रूप में दोनों मोटर गतिविधि और संवेदी क्षमताओं उम्र के साथ गिरावट, यह इन व्यक्तिगत न्यूरॉन्स11,12में दोषों के बारे में मशीनी अंतर्दृष्टि विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस तरह के रूप में, बाद में पूर्व vivo अध्ययन के लिए ब्याज की बरकरार कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि के लिए एक की जरूरत है.
यहाँ, हम सी elegans से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त विशिष्ट न्यूरॉन कोशिकाओं के तेजी से अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रभावी विधि का वर्णन. इस अलगाव विधि लार्वा, किशोर या वयस्क कीड़े पर किया जा सकता है। लार्वा कीड़े से कोशिकाओं के अलगाव पहले झांग एट अल13 द्वारा प्रकाशित किया गया था और यहाँ चर्चा नहीं की जाएगी. यहाँ एक महत्वपूर्ण ध्यान दें कि सभी कीड़े एक ही जीवन के स्तर पर होने की जरूरत है पशु या विभिन्न जीवन चरणों में जानवरों से संदूषण के अधिक पाचन को रोकने के लिए. सूत्रकृमक क्यूटिकल के एंजाइमी और यांत्रिक विघटन, कोलेजन और अन्य संरचनात्मक प्रोटीनों में उच्च एक एक्सोस्केलेटन के माध्यम से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं कोअलगकिया जा सकता है 13,14. कोशिकाओं तो प्रवाह साइटोमेट्री या एंटीबॉडी लेबल चुंबकीय मोती के माध्यम से अलग किया जा सकता है. आमतौर पर, आरएनए वांछित सेल जनसंख्या15के संवर्धन को सुनिश्चित करने के लिए एक फीनॉल और ग्वानिडीन आइसोथियोसाइनेट विधि के माध्यम से अलग किया जाता है। बहुत सावधानी के साथ इन अलग कोशिकाओं को एक संस्कृति फ्लास्क या बहु अच्छी तरह से पकवान में बनाए रखा जा सकता है. इस विधि विशिष्ट न्यूरॉन्स के अध्ययन में एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और आगे culturing के लिए रहते हैं और कार्यात्मक कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान, कई कोशिकाओं सेलुलर रोग के लिए अग्रणी नुकसान के उच्च स्तर जमा, जो कई बुढ़ापे और रोग की स्थिति underlies. पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स उम्र बढ़ने से प्रभावित एक प्रमुख सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि न्यूरोनल उम्र बढ़ने के कई स्तनधारी मॉडल मौजूद हैं, वे चुनौतीपूर्ण और स्थापित करने के लिए महंगा कर रहे हैं. राउंडवार्म Caenorhabditis elegans न्यूरोनल उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है, के रूप में इन जानवरों को कम उम्र है, एक उपलब्ध मजबूत आनुवंशिक उपकरण बॉक्स, और अच्छी तरह से सूचीबद्ध तंत्रिका तंत्र. विधि यहाँ प्रस्तुत एक ट्रांसजेनिक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति के आधार पर विशिष्ट कोशिकाओं के निर्बाध अलगाव के लिए अनुमति देता है. अलग के तहत GFP व्यक्त ट्रांसजेनिक पशु लाइनों, सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों बाहरी क्यूटिकल को दूर करने के लिए पचा रहे हैं और धीरे यंत्रवत् विभिन्न प्रकार के सेल युक्त घोल का उत्पादन करने के लिए बाधित। ब्याज की कोशिकाओं तो फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के माध्यम से गैर-लक्ष्य कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं, या विरोधी GFP-युग्मित चुंबकीय मोती द्वारा. अलग कोशिकाओं तो एक सीमित समय के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है या तुरंत इस तरह के वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर द्वारा प्रतिलेखनात्मक विश्लेषण के रूप में सेल-विशिष्ट पूर्व vivo विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल सी elegansमें विभिन्न न्यूरॉन आबादी के भीतर सेल विशेष प्रतिक्रियाओं के तेजी से और मजबूत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल unc-17के विशिष्ट अलगाव के लिए अनुमति देता है ::GFP सकारात्मक कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स राउंडवार्म सी से इस तरह के सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा और अंतिम रूप के ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

राउंडवार्म Caenorhabditis elegans से विशिष्ट न्यूरोन आबादी का अलगाव

यहाँ, हम लाइव न्यूरोनल कोशिकाओं के विशिष्ट समूहों के सरल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें ट्रांसजेनिक कैनोरहैब्डाइटिस एलिगन्स लाइनों से ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया जाता है। इस विधि विशिष्ट न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित पूर्व vivo अध्ययन की एक किस्म सक्षम बनाता है और आगे अल्पकालिक culturing के लिए कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस से एक विशिष्ट सेल वंश में मूल अलगाव, संस्कृति और प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं की पूछताछ के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ कीड़े या विशिष्ट कोशिका प्रकारों के विभिन्न जीवन चरणों के लिए अनुकूलनशीलता का उच्च स्तर अलग होना है। प्रक्रिया का प्रदर्शन अपने आप को और Nataliya Zahayko, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा ।जानवरों को इकट्ठा करने के बाद, उन्हें पांच मिनट के लिए 1600 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। सभी सुपरनेट को हटा दें और M9 मीडिया के एक मिलीलीटर में कीड़े को फिर से खर्च करें। निलंबन को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें।कीड़े को गोली मारने के लिए पांच मिनट के लिए 1600 बार जी पर सेंट्रलाइज करें। इसके बाद एसडीएस-डीटीटी बफर के 200 माइक्रोलीटर डालें और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कीड़े अब शरीर के साथ झुर्रियों वाले दिखाई देने चाहिए अगर एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे देखा ।इसके बाद, बर्फ-ठंडे आइसोलेशन बफर के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे ट्यूब को फ्लिक करके मिलाएं। कीड़े को गोली मारने के लिए एक मिनट के लिए 13, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट निकालें और आइसोलेशन बफर के एक मिलीलीटर के साथ धोएं।अपकेंद्रित्र और धोने की प्रक्रिया को कुल पांच बार दोहराएं, जिससे हर बार आइसोलेशन बफर को सावधानी से हटाना सुनिश्चित किया जा सके। इसके बाद, स्ट्रेप्टोमाइसिस ग्रिसेस से प्रोटीज़ मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो आइसोलेशन बफर में भंग होकर गोली में शामिल होता है। 10 से 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, ट्यूब के नीचे के खिलाफ एक २०० माइक्रोलीटर माइक्रोपिपेट टिप के साथ ६० से ७० बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा यांत्रिक व्यवधान लागू करने के लिए सुनिश्चित कर रही है ।पाचन के चरण को निर्धारित करने के लिए, पाचन मिश्रण के एक से पांच माइक्रोलीटर को हटा दें, इसे एक ग्लास स्लाइड पर छोड़ दें, और ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इसका निरीक्षण करें। पांच से सात मिनट के बाद कृमि के टुकड़ों में दिखने में कम क्यूटिकल होना चाहिए और कोशिकाओं का घोल आसानी से दिखाई देगा। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लीबोविट्ज के एल-15 माध्यम के 900 माइक्रोलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें, 10% एफबीएस और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।10, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अलग टुकड़े और कोशिकाओं को गोली । गोली कोशिकाओं को दो बार और ठंड एल-15 पूरक मीडिया के साथ धोने के प्रति धोने के मीडिया के एक मिलीलीटर का उपयोग कर । एल-15 पूरक मीडिया के एक मिलीलीटर में गोली कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।फिर शीर्ष परत लें, जो लगभग 700 से 800 माइक्रोलीटर है, और इसे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अलग कोशिकाओं के 10 से 25 माइक्रोलीटर के सेल घनत्व को मापने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या हेमेसाइटोमीटर का उपयोग करें। अलग सेल निलंबन से 10, 000 बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं ।सुपरनैट को त्यागें और एल-15 पूरक माध्यम में पेलेड कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमीटर को ओवरलोड करने से बचने के लिए प्रति मिलीलीटर छह मिलियन से अधिक कोशिकाओं के घनत्व के लिए पुन: प्रवाह करें। फिर, नमूनों को छांटने में सक्षम प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके जीएफपी-सकारात्मक अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं को सॉर्ट करें। जीएफपी-नकारात्मक कोशिकाओं को गैर-सेल-प्रकार-विशिष्ट विश्लेषण के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।इसके बाद, अलग-थलग कोशिकाओं को बाँझ छह-अच्छी प्लेट के कुओं में प्लेट करें, प्लेट को प्लास्टिक के कंटेनर में रखें, कोशिकाओं में नमी जोड़ने के लिए एक नम पोंछ या नरम ऊतक कागज जोड़ें, और 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक १.५ मिलीलीटर RNase मुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एक १.५-मिलीलीटर RNase मुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अलग सेल निलंबन से अपकेंद्रित्र कोशिकाओं । माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, सुपरनिट को हटा दें और एल-15 पूरक माध्यम को धोने के लिए एम9 माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।इसके बाद, कोशिकाओं को 10, 000 बार जी और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें और सुपरनैंट को हटा दें। इस वॉश और अपकेंद्रित्र प्रक्रिया को कुल तीन बार दोहराएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी मीडिया को हटा दिया जाए, जिससे हर बार सुपरनैंट को सावधानी से हटाना सुनिश्चित किया जा सके। फिर, कोशिकाओं में फिनोल और ग्वानिडीन आइसोथियोसाइनेट समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और निलंबन को ध्यान से ऊपर और नीचे पिपेट करें।मिश्रण को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद क्लोरोफॉर्म के 250 माइक्रोलीटर डालें और धीरे-धीरे ट्यूब को 15 से 20 बार उलटा करें। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।10, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज और पांच मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर । एक माइक्रोपिपेट का उपयोग ध्यान से जितना संभव हो शीर्ष जलीय परत के रूप में हटाने के लिए, नीचे कार्बनिक परतों को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । नीचे की परत को एक नए 1.5 मिलीलीटर आरएनए-मुक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।नई ट्यूब में आइसोप्रोपनॉल के 500 माइक्रोलीटर डालकर ट्यूब को उलटा करके मिलाएं। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इस समाधान को इनक्यूबेट करें। फिर 14, 000 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और 20 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर।नमूनों को बर्फ पर रखें और जितना संभव हो उतना आइसोप्रोपैनॉल को हटाने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। धीरे-धीरे ट्यूब के किनारे पर इसे लागू करके ट्यूब में आरएनएसई-मुक्त डबल-डिस्टिल्ड पानी में 70% इथेनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें। 10, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज और पांच मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ।अधिकांश इथेनॉल निकालें और ट्यूब हवा को बर्फ पर तीन से पांच मिनट के लिए सूखने दें। इसके बाद आरएनएसई-फ्री डबल डिफाल्टर पानी के 15 से 20 माइक्रोलीटर डालें। आरएनए एकाग्रता और शुद्धता को मापने के लिए 260 नैनोमीटर पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें।इस अध्ययन में, unc-17: GFP-सकारात्मक कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स निकाले जाते हैं और बाद के पूर्व वीवो अध्ययनों के लिए गोल कृमि C.elegans से अलग कर रहे हैं। UNC-17 जीन C.elegans शरीर भर में व्यक्त की है, और एक वेसिकुलर एसीटिलकोलिन ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसपोर्टर के लिए कोड । इस जीन की अभिव्यक्ति सिर, मिडबॉडी, और पूंछ न्यूरॉन्स, और न्यूरॉन अनुमानों में देखा जा सकता है।यूएनसी-17 के प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ: अलगाव के बाद जीएफपी-पॉजिटिव न्यूरॉन्स, साथ ही असंशोधित N2 जंगली प्रकार के जानवरों से एक संबंधित नकारात्मक नियंत्रण, यहां दिखाया गया है । अलग कोशिकाओं को तीन दिन तक जीवित रह सकते है जब Leibovitz एल-15 मध्यम और 10% FBS के साथ पूरक । जीएफपी-व्यक्त कोलिनेर्गिक न्यूरॉन्स, साथ ही जीएफपी-व्यक्त मांसपेशियों की कोशिकाओं से क्यूपीसीआर के प्रतिनिधि डेटा, यहां दिखाया गया है।कोशिकाओं को सफलतापूर्वक छांटने के बाद, आरएनए को फिनोल और ग्वानिडीन आइसोथियोसायनेट विधि के माध्यम से अलग किया जाता है, जिसके बाद संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए का उत्पादन किया गया था। कोलिनेर्गिक न्यूरॉन-विशिष्ट जीन, टीपीएच-1, एक ट्रिप्टोफान हाइड्रोक्सिलेज, और एसएनबी-1, एक सिनैप्टिक वेसिकल ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति, यूएनसी-17: जीएफपी अलग कोशिकाओं में ऊंचा है। हालांकि, यह अभिव्यक्ति मायो-3: जीएफपी अलग कोशिकाओं में मौजूद नहीं है।विलोम मायो-2 की मांसपेशियों-विशिष्ट मायोसिन-भारी श्रृंखला ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति के साथ सच है, क्योंकि इस जीन की अभिव्यक्ति अलग मांसपेशियों की कोशिकाओं तक सीमित है, लेकिन अलग-थलग चोलिनेर्गिक कोशिकाओं तक सीमित नहीं है। कीड़े को पूरी तरह से इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, कृमि क्यूटिकल के विस्तारित इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप जानवर को कीड़ा मृत्यु या अतिरिक्त तनाव हो सकता है।अलगाव के बाद, कोशिकाओं को या तो समय की अवधि के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, या आरएनए अलगाव और qRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया । सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफोरेसिस माप द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है। यह तकनीक कोशिकाओं के विशिष्ट समूहों के पूर्व वीवो विश्लेषण को सुविधाजनक बना सकती है, जिससे इसके जीवनचक्र के विभिन्न चरणों में बहुकोशिकीय जीवों के संदर्भ में सेल-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की हमारी समझ में सुधार करने में मदद मिलती है।चूंकि इस प्रयोग के दौरान एसडीएस और डीटीटी जैसे रसायनों का उपयोग किया जाता है, इसलिए बफर बनाते और उपयोग करते समय सामान्य प्रयोगशाला सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन किया जाना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

निमेटोड का प्रयोग जर्मलाइन रासायनिक विषाक्तता के व्यापक मूल्यांकन<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

अलगाव और zebrafish भ्रूण से एकल कक्ष की विशेषता

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

मानव हृदय के ऊतकों से Perivascular multipotent अग्रदूत सेल आबादी के अलगाव

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

नवजात माउस अग्न्याशय से कार्यात्मक आइलेट्स की प्रभावी अलगाव

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

न्यूरॉन्स में Intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस के स्थिरीकरण

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

लाइव Caenorhabditis एलिगेंस की आंत में Lysosomal Alkalinization का आकलन

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

केनोहैबडाइटिस एलिगेंस में माइटिस समूह स्ट्रेप्टोकोक्की के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव का अध्ययन

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

समदैशिक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी और स्वचालित कोशिका वंश का विश्लेषण करने के लिए सूचीपत्र caभयावहता हैडिटिस एलिगेंस भ्रूणोद्भव subcellular संकल्प के साथ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

मापने शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता के भीतर caदुष्टता hermaphrodite प्रजनन क्षेत्र एलिगेंस

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...