Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
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Ringraziamo la dott.ssa Jennifer Fox e i membri del laboratorio Khalimonchuk per commenti approfonditi. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).

1. Preparazione e raccolta di vermi invecchiati per l'isolamento cellulare
NOTA: Di seguito è spiegato l'isolamento dei neuroni colinergici dal ceppo transgenico unc-17::GFP (OH13083) ottenuto dal deposito di ceppo Caenorhabditis Genetics Center (CGC) presso l'Università del Minnesota. È imperativo mantenere condizioni sterili per prevenire la contaminazione da funghi o batteri.
<ol><li>Preparare e sincronizzare i worm tramite il metodo di sbiancamento come descritto da ...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

Il nematode C. elegans è un modello consolidato e potente per studiare la salute neuronale e la malattia2. Con ampi strumenti genetici per manipolare questi animali e una quantità gestibile di vari tipi di neuroni mappati con precisione, una grande quantità di dati può essere raccolta con una quantità relativamente piccola di materiale. Qui, illustreremo un metodo ottimizzato per isolare neuroni distinti da animali interi. Interrompendo le proteine cutici esterne del verme, un liquam...

Nel corso degli ultimi decenni, l'organismo modello metazoano Caenorhabditis elegans è stata una risorsa enorme nello studio dei neuroni, circuiti neuronali e il suo ruolo nelle risposte fisiologiche e comportamentali, e neurodegenerative associato all'invecchiamento Malattie. Una caratteristica unica di C. elegans è che gli animali sono trasparenti, permettendo il lignaggio di tutte le cellule somatiche adulte da mappare1. C. elegans ospita anche una quantità gestibile di neuroni, portando alla morfologia e alla connettività del sistema nervoso ben comprese2. Il lignaggio cellulare invariante, breve durata della vita, e l'abbondanza di strumenti genetici ad alto throughput disponibili per C. elegans lo rendono un organismo modello ideale per lo studio dell'invecchiamento all'interno di diverse popolazioni neuronali.
L'invecchiamento dei neuroni e disturbi neurodegenerativi sono complessi, e ogni disturbo ha firme patologiche uniche associate ad esso. Tuttavia, per molti di questi disturbi, come il morbo di Parkinson e di Alzheimer, una caratteristica comune è il carico progressivo di proteine piegate in modo non corretto3,4,5. In entrambe queste malattie, le proteine si piegano in modo equilone e si aggregano all'interno della cellula per causare tossicità, portando infine alla morte cellulare4,5. Per il corretto invecchiamento dei neuroni, l'omeostasi dei mitocondri, più specificamente proteina omeostasi, è importante, in quanto le perturbazioni e la dishomeostasi possono portare alla neurodegenerazione6,7,8. Le cellule sono dotate di vari meccanismi per mantenere l'omeostasi proteica, uno dei quali è la risposta delle proteine spiegata (UPR), un percorso classico in cui i segnali provenienti da reticolato endoplasmico (ER) attivano le cascate di segnali intracellulari, portando ad una risposta9. In forma diquesto UPR ER, i metazoi mostrano una risposta simile alla perdita di omeostasi delle proteine mitocondriali, la cosiddetta UPR mitocondriale (UPRmt)7,8. C. elegans sembra essere l'organismo più basale ad avere un percorso UPRmt confermato e ben definito7.
La funzione/disfunzione di specifiche popolazioni neuronali all'interno di una rete più ampia può essere difficile da valutare a causa della loro connettività intrinseca e complessità3. Tuttavia, c'è spesso la necessità di studiare popolazioni neuronali distinte a causa di malattie specifiche del tipo di cellula con patologie complesse, come quelle associate all'omeostasi delle proteine cellulari alterate. In C. elegans,specifiche popolazioni neuronali possono essere geneticamente manipolate permettendo una facile osservazione in vivo. Il sistema nervoso di C. elegans è costituito principalmente da neuroni, con una piccola percentuale di cellule gliali. Nei vermi di ermafrodite adulti, ci sono circa 302 neuroni, suddivisi in oltre 100 classi diverse2,10. Neuroni come neuroni colinergici predominano nelle giunzioni neuromuscolari, mentre i neuroni dopaminergici sono principalmente coinvolti nella sensazione10,11. Poiché sia l'attività motoria che le capacità sensoriali diminuiscono con l'età, è importante dettagliare le intuizioni meccanicistiche sui difetti in questi singoli neuroni11,12. Come tale, vi è la necessità di un metodo semplice e robusto per isolare le cellule intatte di interesse per i successivi studi ex vivo.
Qui, descriviamo un metodo efficace ottimizzato per il rapido isolamento di specifiche cellule neuronali che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) da C. elegans. Questo metodo di isolamento può essere eseguito su vermi larvali, giovani o adulti. L'isolamento delle cellule dai vermi larvali è stato precedentemente pubblicato da . Una nota importante qui è che tutti i vermi devono essere allo stesso stadio di vita per evitare una digestione eccessiva dell'animale o contaminazione da animali in diverse fasi di vita. Attraverso la rottura sia enzimatica che meccanica della cuticola nematode, un esoscheletro alto nel collagene e in altre proteine strutturali, un'ampia varietà di cellule può essere isolata13,14. Le cellule possono quindi essere isolate tramite citometria di flusso o anticorpi etichettati perline magnetiche. Tipicamente, l'RNA è isolato tramite un fenolo e un metodo isothiocyanato di fenidine per garantire l'arricchimento della popolazione cellulare desiderata15. Con molta cura queste cellule isolate possono essere mantenute in un flacone di coltura o piatto multi-bene. Questo metodo rappresenta uno strumento unico e potente nello studio di neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule vive e funzionali per un'ulteriore coltura.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Durante il processo di invecchiamento, molte cellule accumulano alti livelli di danni che portano alla disfunzione cellulare, che sta alla base di molte condizioni geriatriche e patologiche. I neuroni post-mitotici rappresentano un tipo di cellula principale interessato dall'invecchiamento. Anche se esistono più modelli di mammiferi di invecchiamento neuronale, sono impegnativi e costosi da stabilire. Il nematode Caenorhabditis elegans è un potente modello per studiare l'invecchiamento neuronale, in quanto questi animali hanno una breve durata di vita, una cassetta degli attrezzi genetica robusta disponibile e un sistema nervoso ben catalogato. Il metodo qui presentato consente di un isolamento senza soluzione di continuità di cellule specifiche basato sull'espressione di una proteina fluorescente verde transgenica (GFP). Le linee animali transgeniche che esprimono GFP sotto distinti promotori tipo di cellule sono digerite per rimuovere la cuticola esterna e disturbati delicatamente meccanicamente per produrre liquami contenenti vari tipi di cellule. Le cellule di interesse vengono quindi separate dalle cellule non bersaglio attraverso lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o da perline magnetiche ad accoppiamento anti-GFP. Le cellule isolate possono quindi essere coltivate per un tempo limitato o immediatamente utilizzate per analisi ex vivo specifiche per cellula, come l'analisi trascrizionale tramite PCR quantitativa in tempo reale. Pertanto, questo protocollo consente un'analisi rapida e robusta delle risposte specifiche delle cellule all'interno di diverse popolazioni neuronali in C. elegans.

Il protocollo qui descritto consente l'isolamento specifico dei neuroni colinergici unc-17::GFP-positivi dai nematodi C. elegans per i successivi studi ex vivo come la profilazione dell'espressione genica specifica del tipo di cellula e l'eventuale coltura a breve termine per misurazioni elettrofisiologiche patch-clamp.
Figura 1 Mostra neuroni colinergici unc-17::GFP-posit...

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Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

Qui, presentiamo un protocollo per un semplice isolamento di specifici gruppi di cellule neuronali vive che esprimono proteine fluorescenti verdi dalle linee transgeniche di Caenorhabditis elegans . Questo metodo consente una varietà di studi ex vivo focalizzati su neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule per ulteriori colture a breve termine.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Questo protocollo consente l'isolamento, la coltivazione e l'interrogatorio senza soluzione di continuità delle risposte trascrizionale in una specifica discendenza cellulare da C.elegans. Il vantaggio principale di questo protocollo è l'alto livello di adattabilità alle diverse fasi di vita dei worm o dei tipi di cellule specifiche da isolare. A dimostrare la procedura saremo io e Nataliya Zahayko, una tecnico del nostro laboratorio.Dopo aver raccolto gli animali, centrifugarli a 1600 volte g per cinque minuti. Rimuovere tutti i supernatanti e rimescolare i vermi in un millilitro di mezzi M9. Trasferire la sospensione su un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Centrifuga a 1600 volte g per cinque minuti per pellettare i vermi. Quindi aggiungere 200 microlitri di tampone SDS-DTT e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. I vermi dovrebbero ora apparire rugosi lungo il corpo se visti al microscopio leggero.Quindi, aggiungere 800 microlitri di tampone di isolamento ghiacciato e mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo. Centrifuga a 13.000 volte g e a quattro gradi Celsius per un minuto per pellettare i vermi. Rimuovere il supernatante e lavare con un millilitro di tampone di isolamento.Ripetere il processo di centrifugazione e lavaggio per un totale di cinque volte, assicurandosi di rimuovere con cura il tampone di isolamento ogni volta. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di miscela di proteasi da Streptomyces griseus, sciolti in tampone di isolamento, al pellet. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti, assicurandosi di applicare interruzioni meccaniche tubazioni su e giù da 60 a 70 volte con una punta in micropipetta da 200 microliter contro il fondo del tubo.Per determinare lo stadio della digestione, rimuovere da uno a cinque microlitri della miscela di digestione, lasciarlo cadere su uno scivolo di vetro e ispezionarlo utilizzando un microscopio a coltura tissutale. Dopo cinque o sette minuti, i frammenti di verme dovrebbero avere una cuticola visibilmente ridotta e un liquame di cellule sarà facilmente visibile. Fermare la reazione aggiungendo 900 microlitri del mezzo L-15 di Leibovitz disponibile in commercio, integrato con 10%FBS e penicillina-streptomicina.Centrifuga a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellet frammenti isolati e cellule. Lavare le celle pellettate altre due volte con mezzi integrati L-15 freddi utilizzando un millilitro di supporto per lavaggio. Resopend le cellule pellettate in un millilitro di L-15 supporti integrati, e lasciare sul ghiaccio per 30 minuti.Quindi prendere lo strato superiore, che è di circa 700-800 microlitri, e trasferirlo in un tubo di microcentrifugo. Utilizzare un contatore di celle automatizzato o un emacitometro per misurare la densità cellulare da 10 a 25 microlitri di cellule isolate. Centrifugare le cellule dalla sospensione cellulare isolata a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e rimescolare le cellule pellettate in L-15 integrato medio a una densità cellulare non superiore a sei milioni di cellule per millilitro per evitare di sovraccaricare il citometro di flusso. Quindi, ordinare le celle in base all'espressione positiva della GFP usando un citometro di flusso in grado di ordinare i campioni. Le celle negative GFP possono essere utilizzate come controllo per l'analisi non specifica del tipo di cella.Dopo questo, placcare le cellule isolate nei pozzi di una piastra sterile a sei pozzi, posizionare la piastra in un contenitore di plastica, aggiungere una salvietta umida o carta dei tessuti molli per aggiungere umidità alle cellule e incubare a 20 gradi Celsius. Centrifugare le cellule dalla sospensione cellulare isolata in un tubo di microcentrifugo privo di RNasi da 1,5 millilitri a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere il supernatante e aggiungere 100 microlitri di mezzo M9 per lavare via il mezzo integrato L-15.Quindi, centrifugare le cellule a 10.000 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio e centrifugazione tre volte il totale per assicurarsi che tutti i supporti vengano rimossi, assicurandosi di rimuovere con cura il supernatante ogni volta. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di isotiocianato di fenolo e guanidina alle cellule e pipettare la sospensione su e giù con attenzione.Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di cloroformio e invertire delicatamente il tubo da 15 a 20 volte. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Centrifuga a 10.000 volte g e a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare una micropipetta per rimuovere con cura la maggior parte possibile dello strato acquoso superiore, assicurandosi di non disturbare gli strati organici inferiori. Trasferire lo strato inferiore su un nuovo tubo di microcentrifugo privo di RNasi da 1,5 millilitri.Al nuovo tubo aggiungere 500 microlitri di isopropanolo e mescolare invertendo il tubo. Incubare questa soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi centrifugare il tubo a 14.000 volte g e a 25 gradi Celsius per 20 minuti.Posizionare i campioni sul ghiaccio e utilizzare una micropipetta per rimuovere il più possibile l'isopropanolo. Aggiungere delicatamente un millilitro di 70% di etanolo in acqua distillata doppia senza RNasi al tubo applicandolo sul lato del tubo. Centrifuga a 10.000 volte g e a 25 gradi Celsius per cinque minuti.Rimuovere la maggior parte dell'etanolo e lasciare asciugare l'aria del tubo sul ghiaccio per tre o cinque minuti. Successivamente, aggiungere da 15 a 20 microlitri di acqua distillata doppia senza RNasi. Utilizzare uno spettrofotometro a 260 nanometri per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA.In questo studio, i neuroni colinergici unc-17:GFP-positivi vengono estratti e isolati dai c.elegans del nematode per successivi studi ex vivo. Il gene unc-17 è espresso in tutto il corpo C.elegans, e codici per un trasportatore transmembrana acetilcolina vescicolare. L'espressione di questo gene può essere osservata nei neuroni testa, midbody e coda, e nelle proiezioni neuronali.Qui sono mostrate le micrografie rappresentative della fluorescenza dei neuroni unc-17:GFP-positivi dopo l'isolamento, così come un rispettivo controllo negativo da animali di tipo selvatico N2 non modificato. Le cellule isolate possono rimanere in vita fino a tre giorni se integrate con il mezzo L-15 di Leibovitz e il 10%FBS. I dati rappresentativi del qPCR dei neuroni colinergici che esprimono la GFP, così come le cellule muscolari che esprimono la GFP, sono mostrati qui.Dopo aver smistato con successo le cellule, l'RNA viene isolato attraverso un metodo di isotiocianato di fenolo e guanidina, dopo di che il cDNA è stato prodotto utilizzando un kit di sintesi. L'espressione di geni colinergici specifici dei neuroni, tph-1, un idrossilasi triptofano, e snb-1, un trasportatore sinaptico di vescicola, è elevata in cellule isolate unc-17:GFP. Tuttavia, questa espressione non è presente nelle celle isolate di myo-3:GFP.L'inverso è vero con l'espressione della trascrizione della catena miosina-pesante specifica del muscolo del mio-2, poiché l'espressione di questo gene è limitata alle cellule muscolari isolate, ma non alle cellule colinergiche isolate. È importante incubare completamente i vermi. Tuttavia, l'incubazione prolungata della cuticola del verme può causare la morte del verme o ulteriore stress per l'animale.Dopo l'isolamento, le cellule possono essere coltivate per un certo periodo di tempo o utilizzate per l'isolamento dell'RNA e l'analisi qRT-PCR. I neuroni coltivati possono essere ulteriormente analizzati mediante misurazioni dell'elettroforesi del patch clamp. Questa tecnica potrebbe facilitare l'analisi ex vivo di gruppi specifici di cellule, contribuendo così a migliorare la nostra comprensione delle risposte specifiche delle cellule nel contesto degli organismi multicellulari in varie fasi del suo ciclo di vita.Poiché durante questo esperimento vengono utilizzate sostanze chimiche come SDS e DTT, le procedure generali di sicurezza di laboratorio dovrebbero essere seguite durante la produzione e l'utilizzo di buffer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studiando lo Stress ossidativo causato dagli streptococchi di gruppo Mitis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...