Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
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ジェニファー・フォックス博士とカリモンチュク研究所のメンバーに、洞察力に満ちたコメントをいただき、感謝します。我々は、国立衛生研究所(R01 GM108975からO.K.およびT32 GM107001-01A1からE.M.G.への支援を認める)。

1. 細胞分離のための老化したワームの準備と収集
注:以下に説明すると、ミネソタ大学のカエノルハブティス遺伝学センター(CGC)株リポジトリから得られたトランスジェニックunc-17::GFP株(OH13083)からのコリン作動性ニューロンの単離です。 真菌や細菌からの汚染を防ぐために、滅菌条件を維持することが不可欠です。
<ol><li>T. Stiernagle16で説...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

回虫C.エレガンスは、神経の健康と病気2を研究するための確立された強力なモデルです。これらの動物を操作するための十分な遺伝的ツールと正確にマッピングされた様々なニューロンタイプの管理可能な量を使用すると、比較的少量の材料で大量のデータを収集することができます。ここでは、動物全体から異なるニューロンを分離するための最適化された方法を?...

過去数十年にわたり、メタゾンモデル生物のカエオルハブ炎エレガンスは、ニューロン、ニューロン回路、生理的および行動的応答におけるその役割、および老化関連神経変性の研究において、多大な財産となっています。病気。C.エレガンスのユニークな特徴は、動物が透明であり、すべての成人体細胞の系統をマッピングできるようにすることです 1.C. エレガンスはまた、神経細胞の管理可能な量を収容し、神経系の形態と接続性がよく理解されている2.C.エレガンスで利用可能な不変細胞系統、短い寿命、および豊富なハイスループット遺伝的ツールは、異なる神経集団内の老化の研究のための理想的なモデル生物を作る。
ニューロンの老化と神経変性疾患は複雑であり、各疾患はそれに関連するユニークな病理学的特徴を有する。しかし、パーキンソン病やアルツハイマー病などのこれらの疾患の多くでは、一般的な特徴は、誤ったたんぱく質3、4、5の進行性負荷である。これらの疾患の両方において、タンパク質は細胞内で誤って折り畳まれ、凝集して毒性を引き起こし、最終的には細胞死4、5につながる。ニューロンの適切な老化のために、ミトコンドリアの恒常性、より具体的にはタンパク質恒常性は、摂動および嚥下障害が神経変性6、7、8を引き起こす可能性があるとして重要である。細胞はタンパク質恒常性を維持するための様々なメカニズムを備え、1つは展開されたタンパク質応答(UPR)である-小球網膜(ER)からのシグナルが細胞内シグナルカスケードを活性化し、転写につながる古典的な経路である。応答9.このUPRERに似て、メタゾンはミトコンドリアタンパク質恒常性の喪失に対して同様の応答を示し、いわゆるミトコンドリアUPR(UPRmt)7,8である。C. エレガンスは、確認され、明確に定義されたUPRmt経路7を持っている最も基底生物であるように見えます.
大規模なネットワーク内の特定のニューロン集団の機能/機能不全は、その本質的な接続性と複雑さ3を評価するのが難しい場合があります。しかし、細胞性タンパク質恒常性障害に関連するものなど、複雑な病理を有する細胞型特異的疾患のために、異なる神経集団を研究する必要が生じることが多い。C.エレガンスでは、特定の神経集団を遺伝的に操作し、生体内での顔の観察を可能にする。C.エレガンスの神経系は、主に神経細胞で構成され、グリア細胞の割合は小さい。成人のヘルマクロダイトワームでは、約302のニューロンがあり、100以上の異なるクラス2、10に細分化されている。コリン作動性ニューロンなどのニューロンは神経筋接会で優勢であり、ドーパミン作動性ニューロンは主に感覚10,11に関与する。運動活動と感覚能力の両方が年齢とともに低下するにつれて、これらの個々のニューロンの欠陥に関する機械的洞察を詳細に述べる必要があります11,12.そのため、その後のex vivo研究のために目的とする無傷の細胞を単離するシンプルで堅牢な方法が必要である。
ここでは、C.エレガンスから緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する特定の神経細胞を迅速に単離するための最適化された有効な方法について説明する。この分離方法は、幼虫、若年性または成人のワームに対して行うことができる。幼虫ワームからの細胞の分離は、以前にZhang et al. al.13によって発表され、ここでは議論されません。ここで重要な注意事項は、すべてのワームが異なるライフステージで動物の過剰消化や動物からの汚染を防ぐために同じライフステージにある必要があることです。線虫キューティクルの酵素および機械的破壊の両方を通じて、コラーゲンおよび他の構造タンパク質の高い外骨格は、多種多様な細胞を単離することができる13、14。細胞は、その後、フローサイトメトリーまたは抗体標識磁気ビーズを介して単離することができる。典型的には、RNAは、所望の細胞集団15の濃縮を確実にするためにフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離される。多くの注意を払って、これらの単離された細胞は、培養フラスコまたはマルチウェル皿で維持することができる。この方法は、特定のニューロンの研究におけるユニークで強力なツールを表し、さらなる培養のための生細胞および機能細胞を分離する能力を有する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

老化プロセスの間に, 多くの細胞は、細胞機能障害につながる損傷の高レベルを蓄積します, 多くの老人および病理学的状態の下に.有人性後ニューロンは、加齢の影響を受ける主要な細胞型を表します。神経老化の複数の哺乳類モデルが存在するが、それらは確立するために挑戦的で高価である。回虫のカエモルハブ炎エレガンスは、これらの動物は短い寿命、利用可能な堅牢な遺伝的ツールボックス、およびよくカタログ化された神経系を持っているので、神経老化を研究するための強力なモデルです。本明細書に提示される方法は、トランスジェニック緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいて特定の細胞をシームレスに単離することを可能にする。異なる、細胞型特異的プロモーターの下でGFPを発現するトランスジェニック動物株は、外側のキューティクルを除去するために消化され、様々な細胞タイプを含むスラリーを生成するために穏やかに機械的に破壊される。その後、目的の細胞は、蛍光活性化細胞選別、または抗GFP結合磁気ビーズによって非標的細胞から分離されます。その後、単離された細胞を限られた時間で培養するか、リアルタイム定量PCRによる転写分析などの細胞特異的な生体内分析に直ちに使用することができます。したがって、このプロトコルは、C.エレガンスの異なるニューロン集団内の細胞特異的応答の迅速かつ堅牢な分析を可能にする。

ここで説明するプロトコルは、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングおよび最終的な結果のような後続のex vivo研究のための回虫C.エレガンスからのunc-17::GFP陽性コリン作動性ニューロンの特異的な単離を可能にするパッチクランプ電気生理学測定のための短期培養。
図1は、unc-17<...

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Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex vivo研究を可能にし、さらに短期的な培養のために細胞を分離する能力を有する。

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

このプロトコルは、C.elegansからの特定の細胞系統における転写応答のシームレスな分離、培養、および尋問を可能にする。このプロトコルの主な利点は、分離するワームまたは特定の細胞タイプの異なるライフステージへの適応性の高いレベルです。この手順を実証することは、私と私たちの研究室の技術者であるナタリヤ・ザハイコです。動物を採取した後、5分間1600倍gで遠心分離する。上清をすべて取り除き、M9メディアの1ミリリットルでワームを再中断します。懸濁液を1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。1600回gで遠心分離機を5分間ペレット化し、ワームをペレット化する。その後、200マイクロリットルのSDS-DTTバッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。光顕微鏡で見ると、ワームは体に沿ってしわになっているように見えるはずです。次に、800マイクロリットルの氷冷分離バッファーを加え、チューブを軽くフリックして混ぜます。13,000倍gで遠心分離機、4度で1分間ワームをペレットします。上清を取り除き、1ミリリットルの分離バッファーで洗います。遠心分離を繰り返し、洗浄プロセスを合計5回、毎回分離バッファーを慎重に取り除きます。この後、ストレプトマイセス・グリセウスから100マイクロリットルのプロテアーゼ混合物を添加し、分離緩衝液に溶解し、ペレットに加える。室温で10〜15分間インキュベートし、チューブの底部に対して200マイクロピペットチップで60〜70回上下にピペットを入れ、機械的破壊を適用することを確認します。消化の段階を決定するには、消化混合物の1〜5マイクロリットルを取り除き、ガラススライドに落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。5〜7分後、ワーム断片は目に見えてキューティクルを減少させ、細胞のスラリーが容易に見えるはずです。10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシンを添加した、市販のライボヴィッツのL-15培地の900マイクロリットルを添加することによって反応を停止する。遠心分離機は10,000倍gで、4度で5分間、単離した断片および細胞をペレットにする。ペレット化された細胞を、1回の洗浄につき1ミリリットルの培地を使用して、冷たいL-15補充培地でさらに2回洗浄します。ペレット化された細胞をL-15補充培地の1ミリリットルで再懸濁し、氷の上に30分間放置する。その後、約700〜800マイクロリットルの最上層を取り、マイクロ遠心チューブに移します。自動化された細胞カウンターまたはマシトメーターを使用して、単離された細胞の10〜25マイクロリットルの細胞密度を測定します。分離細胞懸濁液から遠心分離細胞を10,000 gで、摂氏4度で5分間培養した。上清を捨て、フローサイトメーターの過負荷を避けるために、L-15補充培地中のペレット化細胞を1ミリリットル当たり600万個以下の細胞密度に再懸濁します。次いで、サンプルを選別し得るフローサイトメーターを用いてGFP陽性発現により細胞を並べ替える。GFP陰性細胞は、非細胞型特異的解析のコントロールとして使用できます。この後、単離した細胞を無菌の6ウェルプレートの井戸にプレートし、プレートをプラスチック容器に入れ、湿ったワイプまたは柔らかいティッシュペーパーを加えて細胞に水分を加え、摂氏20度でインキュベートします。10,000グラムのRNaseフリーマイクロ遠心分離チューブ内の単離された細胞懸濁液からの遠心分離細胞と摂氏4度で5分間。マイクロピペットを使用して上清を取り除き、100マイクロリットルのM9培地を加え、L-15補充培地を洗い流します。次に、細胞を10,000倍gで5分間摂氏4度で遠心分離し、上清を取り除きます。この洗浄と遠心分離プロセスを合計3回繰り返して、すべての媒体が取り除かれるようにし、毎回上清を慎重に取り除きます。次に、フェノールとグアニジンイソチオシアネート溶液を1ミリリットル加え、懸濁液を上下にピペットして慎重に添加する。混合物を室温で5分間インキュベートする。この後、250マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを15~20回軽く反転します。室温で5分間インキュベートします。10,000倍gの遠心分離機と摂氏25度で5分間。マイクロピペットを使用して、最上部の水層をできるだけ慎重に取り除き、底部の有機層を乱さないようにします。底層を新しい1.5ミリリットルRNaseフリーマイクロ遠心分離チューブに移します。新しいチューブに、イソプロパノールの500マイクロリットルを追加し、チューブを反転させることによって混合します。この溶液を室温で5分間インキュベートします。その後、チューブを14,000倍g、摂氏25度で20分間遠心分離します。サンプルを氷の上に置き、マイクロピペットを使用してできるだけ多くのイソプロパノールを取り除きます。チューブの側面に塗布して、RNaseフリーの二重蒸留水に70%エタノールを1ミリリットル加えてチューブに加えます。10,000倍gの遠心分離機と摂氏25度で5分間。エタノールの大部分を取り除き、チューブを氷の上で3〜5分間空気乾燥させます。この後、RNaseフリーの二重蒸留水を15~20マイクロリットル加えます。260ナノメートルの分光光度計を使用して、RNA濃度と純度を測定します。この研究では、unc-17:GFP陽性コリン作動性ニューロンが抽出され、その後のex vivo研究のために回虫C.elegansから単離される。unc-17遺伝子は、C.elegans本体全体に発現し、静脈アセチルコリン膜貫通トランスポーターのコードを示す。この遺伝子の発現は、頭、中身、尾神経、およびニューロンの突起で観察することができる。単離後のunc-17:GFP陽性ニューロンの代表的な蛍光顕微鏡写真、ならびに未改変N2型動物からのそれぞれの陰性対照を示す。孤立した細胞は、ライボヴィッツのL-15培地および10%FBSを補充すると、最大3日間生き続けることができます。GFP発現コリン作動性ニューロンからのqPCRの代表的なデータは、GFP発現筋細胞と同様に、ここに示されている。細胞の選別に成功した後、RNAはフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離され、その後、cDNAは合成キットを用いて産生された。コリン作動性ニューロン特異的遺伝子の発現は、tph-1、トリプトファンヒドロキシラーゼ、およびシナプス性小胞輸送体であるsnb-1が、単離した17:GFP細胞において上昇する。しかし、この発現はmyo-3:GFP単離細胞には存在しない。この遺伝子の発現は単離された筋肉細胞に限定されるが、単離されたコリン作動性細胞に限定されるので、筋特異的なミオシン重鎖転写産物の発現に対して逆が当てはまる。ワームを完全にインキュベートすることが重要です。しかし、ワームキューティクルの拡張インキュベーションは、ワーム死または動物への追加のストレスをもたらす可能性があります。分離後、細胞は一定期間培養するか、RNAの単離およびqRT-PCR分析に使用することができます。培養ニューロンは、パッチクランプ電気泳動測定により更に解析することができる。この技術は、細胞の特定のグループのex vivo分析を容易にし、それによって、そのライフサイクルの様々な段階で多細胞生物の文脈における細胞特異的応答の理解を深めるのに役立つ可能性があります。この実験ではSDSやDTTなどの化学物質を使用するので、バッファの作成や使用時には一般的なラボの安全手順に従う必要があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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