Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
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우리는 제니퍼 폭스 박사와 칼리몬축 연구소의 회원들에게 통찰력있는 의견에 감사드립니다. 우리는 건강의 국가 학회에서 지원을 인정 (R01 GM108975 O.K.와 T32 GM107001-01A1 E.M.G.에).

1. 세포 격리를위한 세 벌레의 준비 및 수집
참고: 아래에 설명된 것은 미네소타 대학의 케노하브디티스 유전학 센터(CGC) 균주 저장소에서 얻은 형질전환 unc-17:GFP균주(OH13083)에서 콜린성 뉴런의 분리입니다. 곰팡이 나 박테리아의 오염을 방지하기 위해 멸균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.
<ol><li>T. Stiernagle16에의해 설명된 바와 같이 표백 ?...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

둥근 벌레 C. 예쁜 꼬마는 신경 건강과 질병을 연구하는 잘 설립되고 강력한 모델입니다2. 이러한 동물을 조작할 수 있는 충분한 유전 적 도구와 정확하게 매핑 된 다양한 뉴런 유형의 관리 가능한 양을 사용하면 비교적 적은 양의 재료로 많은 양의 데이터를 수집 할 수 있습니다. 여기서는 전체 동물로부터 뚜렷한 뉴런을 분리하는 최적화된 방법을 설명합니다. 벌레의 외?...

지난 수십 년 동안, 메타조안 모델 유기체 인 Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 뉴런, 신경 회로 및 생리 및 행동 반응에서의 역할 및 노화 관련 신경 퇴행성 연구에 엄청난 자산이었습니다. 질병. C. elegans의 유일한 특징은 동물이 투명하다는 것입니다, 모든 성인 체세포의 혈통이매핑될 수 있도록 1. C. 예쁜꼬마선충은 또한 신경의 관리 가능한 양을 항구, 잘 이해되는 신경계의 형태와 연결로 이끌어 내는2. 불변 세포 혈통, 짧은 수명, 그리고 C. elegans에 사용할 수 있는 높은 처리량 유전 도구의 풍부는 다른 신경 인구 내의 노화의 연구를 위한 이상적인 모형 유기체합니다.
뉴런과 신경 퇴행성 질환의 노화는 복잡하며 각 장애에는 독특한 병리학 적 서명이 있습니다. 그러나, 파킨슨병및 알츠하이머병과 같은 이러한 장애의 많은 경우, 일반적인 특징은 잘못 접힌단백질의 점진적 하중3,4,5이다. 이 두 질병 에서, 단백질잘못 접고 세포 내에서 집합 독성을 일으킬,궁극적으로 세포 죽음으로 이어지는 4,5. 뉴런의 적절한 노화를 위해, 미토콘드리아의 항상성, 보다 구체적으로 는 단백질 항상성, 관동 및 dyshomeostasis신경변성으로 이어질 수 있기 때문에, 중요하다 6,7,8. 세포는 단백질 항상성을 유지하기 위해 다양한 메커니즘을 갖추고 있습니다, 하나는 전개 된 단백질 반응 (UPR)-세포 내 망상 (ER)에서 신호가 세포 내 신호 캐스케이드를 활성화하는 고전적인 통로인, 전사로 이끌어 냅니다 응답9. 이러한 UPRER과유사하게, 메타조안은 미토콘드리아 단백질 항상성의 손실에 유사한 반응을 나타내며, 소위 미토콘드리아 UPR(UPR mt)7,8. C. 예쁜꼬마선충은 확인되고 잘 정의된 UPRmt 통로7을가지는 가장 기초유기체인 것으로 보인다.
더 큰 네트워크 내의 특정 뉴런 집단의 기능/기능 장애는 본질적인 연결성과 복잡성으로 인해 평가하기 어려울 수 있습니다3. 그러나, 수시로 손상된 세포 단백질 항상성과 관련되었던 것과 같은 복잡한 병리학을 가진 세포 모형 특정 질병 때문에 명백한 신경 인구를 공부하는 필요가 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서,특정 신경 인구는 생체 내에서 허구 관찰을 허용하는 유전으로 조작될 수 있습니다. C. elegans의 신경계는 주로 신경교세포의 작은 비율로 뉴런으로 구성됩니다. 성인 헤르마로디테 웜에는 약 302개의 뉴런이 있으며, 100개이상의 서로 다른 클래스 2,10으로세분화되어 있다. 해 신경 세포와 같은 뉴런은 신경 근육 접합부에서 우세한 반면, 도파민성 뉴런은 주로 감각10,11에관여합니다. 운동 활동과 감각 능력이 나이가 들면서 감소함에 따라, 이러한 개별 뉴런의 결함에 대한 기계적 통찰력을 자세히 설명하는 것이 중요합니다11,12. 이와 같이, 후속 생체 내 연구에 대한 관심 있는 세포를 온전한 세포를 분리하는 간단하고 강력한 방법에 대한 필요성이 있다.
여기서, 우리는 C. elegans에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 특정 신경 세포의 신속한 격리를위한 최적화 된 효과적인 방법을 설명합니다. 이 격리 방법은 애벌레, 청소년 또는 성인 웜에서 수행 할 수 있습니다. 애벌레 벌레로부터 세포의 격리는 이전에 장 외13에 의해 간행되었으며 여기에서 논의되지 않을 것이다. 여기서 중요한 참고는 모든 벌레가 다른 삶의 단계에서 동물의 과잉 소화 또는 오염을 방지하기 위해 동일한 삶의 단계에 있어야한다는 것입니다. 선충 표피의 효소 및 기계적 중단을 통해, 콜라겐 및 기타 구조 단백질이 높은 외골격, 다양한 세포를13,14로분리할 수 있다. 세포는 그 때 유동 세포 측정 또는 자기 비드표지된 항체를 통해 분리될 수 있습니다. 전형적으로, RNA는 원하는 세포 집단(15)의 농축을 보장하기 위해 페놀 및구아니딘 이소티오차네이트 방법을 통해 단리된다. 많은 주의를 기울여 이러한 단리된 세포는 배양 플라스크 또는 다중 웰 접시에서 유지될 수 있다. 이 방법은 특정 뉴런의 연구에서 독특하고 강력한 도구를 나타내며 추가 배양을 위해 살아있는 세포와 기능성 세포를 분리할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

노화 과정 동안, 많은 세포는 많은 노인 및 병리 조건의 기초가 세포 기능 장애로 이어지는 손상의 높은 수준을 축적. 유사 분열 후 뉴런은 노화에 의해 영향을받는 주요 세포 유형을 나타냅니다. 뉴런 노화의 여러 포유류 모델이 존재하지만, 그들은 확립하기 어렵고 비용이 많이 듭니다. 둥근 벌레 예쁜꼬마선충은 이 동물들이 짧은 수명, 사용 가능한 강력한 유전 도구 상자 및 잘 분류된 신경계를 가지고 있기 때문에 신경 노화를 연구하는 강력한 모델입니다. 본원에 제시된 방법은 형질전환 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현에 기초하여 특정 세포의 원활한 분리를 허용한다. GFP를 발현하는 형질전환 동물 라인은 뚜렷한 세포 유형 특이적 프로모터로 소화되어 외부 표피를 제거하고 기계적으로 기계적으로 다양한 세포 유형을 함유하는 슬러리를 생성하도록 중단된다. 관심있는 세포는 형광 활성화 세포 선별을 통해 비 표적 세포로부터 분리되거나 반대로 GFP 결합 된 자기 구슬에 의해 분리됩니다. 단리된 세포는 제한된 시간 동안 배양되거나 실시간 정량적 PCR에 의한 전사 분석과 같은 세포 특이적 생체 분석에 즉시 사용될 수 있다. 따라서, 이 프로토콜은 C. elegans에있는 다른 신경 인구 내의 세포 특정 반응의 신속하고 강력한 분석을 허용합니다.

여기에 기술된 프로토콜은 unc-17의특정 분리를 허용합니다 ::GFP 양성 콜린성 뉴런은 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링 및 최종과 같은 후속 생체 내 연구를 위해 둥근 벌레 C. elegans에서 패치 클램프 전기 생리학 측정을 위한 단기 배양.
그림 1은 unc-17::GFP양성 콜린성 뉴런을 정상 설...

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Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

이 프로토콜은 C.elegans의 특정 세포 혈통에서 전사 반응의 원활한 격리, 배양 및 심문을 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 격리될 웜 또는 특정 세포 유형의 다른 수명 단계에 대한 높은 수준의 적응성입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 나탈리야 자하이코 (Nataliya Zahayko)가 될 것입니다.동물을 수집 한 후 원심 분리는 5 분 동안 1600 배 g로 분리합니다. 모든 상체를 제거하고 M9 미디어의 한 밀리리터에서 웜을 다시 일시 중지합니다. 서스펜션을 1.5밀리터 마이크로센심분리기 튜브로 이송합니다.원심분리기는 벌레를 펠릿하는 데 5분 동안 1600배 g의 원심분리기. 그런 다음 SDS-DTT 버퍼 200 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 벌레는 지금 가벼운 현미경의 밑에 보는 경우에 바디를 따라 주름이 있는 것처럼 보일 것입니다.다음으로, 얼음 차가운 절연 버퍼 800 마이크로리터를 넣고 튜브를 부드럽게 가볍게 가볍게 섞습니다. 원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 1분간 벌레를 배출합니다. 상체를 제거하고 절연 버퍼 1 밀리리터로 세척합니다.원심분리를 반복하고 총 5회 세척하여 매번 격리 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 그 후, 격리 완충액에 용해된 연쇄상 구균에서 프로테아제 혼합물 100마이크로리터를 펠릿에 넣습니다. 10~15분 동안 실온에서 배양하여 튜브 바닥에 200마이크로리터 마이크로피펫 팁으로 60~70회 위아래로 파이프를 사용하여 기계적 중단을 적용해야 합니다.소화의 단계를 결정하기 위해 소화 혼합물의 1 ~ 5 마이크로 리터를 제거하고 유리 슬라이드에 떨어 뜨리고 조직 배양 현미경을 사용하여 검사하십시오. 5~7분 후에, 벌레 단편은 눈에 띄게 감소된 표피를 가져야 하고 세포의 슬러리가 쉽게 보일 것입니다. 10%의 FBS와 페니실린 연쇄 절제술을 보충한 상용 Leibovitz의 L-15 배지의 900 마이크로리터를 추가하여 반응을 중단하십시오.원심분리기는 10, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 분리된 단편과 세포를 펠릿합니다. 차가운 L-15 보충 매체로 펠릿 세포를 두 번 더 씻는다. L-15 보충 된 매체의 1 밀리리터에서 펠릿 세포를 다시 중단하고 30 분 동안 얼음에 둡니다.그런 다음 약 700 ~800 마이크로리터인 상단 층을 가져 가서 마이크로 센심 분리튜브로 옮김하십시오. 자동화된 세포 카운터 또는 패혈계를 사용하여 격리 된 세포의 10 ~ 25 마이크로 리터의 세포 밀도를 측정합니다. 분리된 세포 현탁액으로부터의 원심분리기 세포는 10, 000배, 섭씨 4도에서 5분 동안.수퍼네티드를 버리고 L-15의 펠렛 세포를 밀리리터당 600만 세포 이하의 세포 밀도로 보충하여 유동 세포계의 과부하를 피한다. 그런 다음 샘플을 정렬할 수 있는 유동 사이토미터를 사용하여 GFP 양성 식으로 세포를 정렬합니다. GFP-음성 세포는 비세포 유형 별 분석을 위한 대조군으로 사용될 수 있다.그 후, 격리된 세포를 멸균 6웰 플레이트의 우물에 접시를 놓고, 접시를 플라스틱 용기에 넣고, 젖은 닦기 또는 연조직 용지를 추가하여 세포에 수분을 추가하고, 섭씨 20도에서 배양한다. 1.5 밀리리터 RNase 프리 마이크로센트 심분리기 튜브에서 분리 된 세포 현탁액에서 원심 분리 기 세포는 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 5 분 동안. 마이크로 파이프를 사용하여 상체를 제거하고 M9 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하여 L-15 보충 매체를 씻어 내도록합니다.다음으로, 세포를 10, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상체를 제거합니다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 총 3회 반복하여 모든 미디어가 제거되도록 매번 상퍼를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 페놀과 구아니딘 이소티오카네이트 용액 1밀리리터를 세포에 넣고 서스펜션을 조심스럽게 위아래로 피펫합니다.5 분 동안 실온에서 혼합물을 배양. 그 후, 클로로폼 250 마이크로리터를 추가하고 튜브를 15~20회 부드럽게 반전시면 됩니다. 실온에서 5분간 배양하세요.원심분리기는 10, 000배, 섭씨 25도에서 5분간. 마이크로파이프를 사용하여 가능한 한 많은 위 수성 층을 조심스럽게 제거하여 하단 유기 층을 방해하지 않도록 하십시오. 바닥 층을 새로운 1.5 밀리리터 RNase 프리 마이크로 센세이처유 튜브로 옮기십시오.새로운 튜브에 이소프로판올 500 마이크로리터를 넣고 튜브를 반전시켜 섞습니다. 이 솔루션을 실온에서 5분간 배양합니다. 그런 다음 튜브를 14, 000배, 섭씨 25도에서 20분 동안 원심분리합니다.샘플을 얼음 위에 놓고 마이크로 파이프를 사용하여 가능한 한 많은 이소프로파놀을 제거하십시오. 튜브 측면에 적용하여 RNase 가 없는 이중 증류수에 70%에탄올 1밀리리터를 튜브에 부드럽게 넣습니다. 원심분리기는 10, 000배, 섭씨 25도에서 5분간.에탄올의 대부분을 제거하고 튜브가 얼음에 공기 건조하게 3 ~ 5 분. 그 후, RNase 가 없는 이중 증류수 15~20마이크로리터를 추가합니다. RNA 농도 및 순도를 측정하기 위해 260 나노미터에서 분광계를 사용합니다.이 연구에서는, unc-17:GFP 양성 콜린성 뉴런추출 하 고 후속 ex vivo 연구에 대 한 둥근 벌레 C.elegans에서 격리. unc-17 유전자는 C.elegans 바디를 통해, 및 vesicular 아세틸콜린 막 수송에 대한 코드에 걸쳐 표현됩니다. 이 유전자의 발현은 머리, 중간 체 및 꼬리 뉴런 및 뉴런 투영에서 관찰될 수 있다.분리 후 Unc-17:GFP 양성 뉴런의 대표적인 형광 현미경 및 수정되지 않은 N2 야생 형 동물의 각각의 부정적인 제어가 여기에 나와 있습니다. 라이보비츠의 L-15 배지와 10%의 FBS로 보충하면 격리된 세포는 최대 3일까지 살아남을 수 있습니다. GFP 발현 식 콜린 뉴런뿐만 아니라 GFP 발현 근육 세포로부터 qPCR의 대표적인 데이터가 여기에 나와 있다.세포를 성공적으로 선별한 후, RNA는 페놀 및 구아니딘 이소티오카네이트 방법을 통해 분리되며, 그 후 cDNA는 합성 키트를 사용하여 생성되었다. 콜린성 뉴런 특이적 유전자, tph-1, 트립토판 하이드록실라제 및 시냅스 소포 수송기인 스네브-1의 발현은 unc-17:GFP 절연 세포에서 상승된다. 그러나, 이 발현은 근-3:GFP 절연 세포에 존재하지 않는다.역은 근생-2의 근육 특이적 미신-헤비 사슬 녹취록의 발현과 함께 사실이며, 이 유전자의 발현은 고립된 근육 세포로 제한되지만, 고립된 콜린세포는 아니다. 웜을 완전히 인큐베이팅하는 것이 중요합니다. 그러나, 벌레 큐티클의 확장 된 잠복은 동물에 웜 죽음 또는 추가 스트레스를 초래할 수 있습니다.격리 후, 세포는 시간 동안 배양되거나 RNA 격리 및 qRT-PCR 분석을 위해 사용될 수 있다. 배양된 뉴런은 패치 클램프 전기전도 측정에 의해 더 분석될 수 있다. 이 기술은 세포의 특정 단의 ex vivo 분석을 용이하게 할 수 있습니다, 따라서 그것의 수명 주기의 다양 한 단계에서 다세포 유기체의 맥락에서 세포 특정 응답의 우리의 이해를 향상 하는 데 도움이.이 실험 중에 SDS 및 DTT와 같은 화학 물질이 사용되므로 버퍼를 만들고 사용하는 동안 일반적인 실험실 안전 절차를 따라야 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

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라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...