Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi takker Dr. Jennifer Fox og medlemmene av Khalimonchuk laboratoriet for innsiktsfulle kommentarer. Vi erkjenner støtten fra National Institutes of Health (R01 GM108975 til OK og T32 GM107001-01A1 til E.M.G.).

1. utarbeidelse og innsamling av alderen ormer for celle isolasjon
Merk: forklart nedenfor er isolering av kolinerge neurons fra transgene UNC-17:: GFP STAMME (OH13083) Hentet fra Caenorhabditis genetikk Center (CGC) stamme depotet ved University of Minnesota. Det er viktig å opprettholde sterile forhold for å hindre forurensning fra sopp eller bakterier.
<ol><li>Klargjør og Synkroniser ormer via bleke metoden som beskrevet av T. Stiernagle16. For...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

Roundworm C. elegans er en veletablert og mektig modell for å studere neuronal helse og sykdom2. Med rikelig genetisk verktøy for å manipulere disse dyrene og håndterbare mengde presist kartlagt ulike Nevron typer, kan en god del data samles med en relativt liten mengde materiale. Her skisserer vi en optimalisert metode for å isolere distinkte neurons fra hele dyr. Ved å forstyrre ormen ytre cuticle proteiner, kan en slurry av ulike celletyper isoleres, inkludert neurons og muskelce...

I løpet av de siste ti årene har metazoan modellen organisme Caenorhabditis elegans vært en enorm ressurs i studiet av neurons, neuronal kretser og dens rolle i fysiologiske og atferdsmessige responser, og aldring-assosiert nevrodegenerative Sykdommer. En unik funksjon i C. elegans er at dyrene er gjennomsiktige, noe som åpner for avstamning av alle voksne somatiske celler som skal tilordnes1. C. elegans også havner håndterlig mengde neurons, som fører til morfologi og tilkobling av nervesystemet blir godt forstått2. Den invariant celle avstamning, kortlevetid, og overflod av høy gjennomstrømming genetiske verktøy tilgjengelig for C. elegans gjør det til en ideell modell organisme for studiet av aldring innenfor ulike neuronal populasjoner.
Aldring av neurons og nevrodegenerative lidelser er komplekse, og hver lidelse har unike patologiske signaturer knyttet til den. Men for mange av disse lidelsene, slik som Parkinsons og Alzheimers sykdom, en felles funksjon er den progressive belastningen av misfolded proteiner3,4,5. I begge disse sykdommene, proteiner misfold og samlet i cellen for å forårsake toksisitet, til slutt fører til celle død4,5. For riktig aldring av neurons, homeostase av mitokondrier, mer spesifikt protein homeostase, er viktig, som forstyrrelser og dyshomeostasis kan føre til neurodegeneration6,7,8. Cellene er utstyrt med ulike mekanismer for å opprettholde protein homeostase, som er den utfoldet proteinresponsen (UPR) – en klassisk vei der signaler fra endoplasmatiske retikulum (ER) aktiverer intracellulære signal kaskader, noe som fører til en transcriptional svar9. Beslektet med denne UPRer, Metazoer vise et lignende svar på tap av mitokondrie protein homeostase, den såkalte mitokondrie UPR (UPRMt)7,8. C. elegans synes å være den mest basale organismen å ha en bekreftet og veldefinert UPRMt Pathway7.
Funksjonen/dysfunksjon av spesifikke neuronal populasjoner innenfor et større nettverk kan være vanskelig å vurdere på grunn av deres iboende tilkobling og kompleksitet3. Det er imidlertid ofte behov for å studere distinkte neuronal populasjoner på grunn av celle type-spesifikke sykdommer med komplekse patologi, slik som de som er forbundet med nedsatt cellulær protein homeostase. I C. eleganskan spesifikke neuronal populasjoner være genetisk manipulert slik at facile observasjon in vivo. Nervesystemet i C. elegans består hovedsakelig av neurons, med en liten prosentandel av gliacellene celler. I voksen Hermafroditt ormer, det er ca 302 neurons, inndelt i over 100 forskjellige klasser2,10. Neurons som kolinerge neurons dominerer i nevromuskulær veikryss, mens dopaminerg neurons er primært involvert i sensasjon10,11. Som både motorisk aktivitet og sensoriske evner avta med alderen, er det viktig å detalj mekanistisk innsikt om defekter i disse individuelle neurons11,12. Som sådan er det behov for en enkel og robust metode for å isolere intakte celler av interesse for senere ex vivo studier.
Her beskriver vi en optimalisert effektiv metode for rask isolering av spesifikke neuronal celler som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) fra C. elegans. Denne isolasjons metoden kan utføres på larvestadiet, juvenile eller voksen ormer. Isolering av celler fra larvestadiet ormer ble tidligere utgitt av Zhang et al.13 og vil ikke bli diskutert her. Et viktig notat her er at alle ormer må være på samme liv scenen for å hindre over-fordøyelsen av dyret eller forurensning fra dyr i ulike stadier. Gjennom både enzymatisk og mekanisk forstyrrelse av nematode cuticle, en Exoskeleton høy i kollagen og andre strukturelle proteiner, et bredt utvalg av celler kan isoleres13,14. Celler kan deretter isoleres via strømnings flowcytometri eller antistoff merket magnetiske perler. Vanligvis er RNA isolert via en fenol-og guaniniumtiocyanat isothiocyanate metode for å sikre berikelse av ønsket celle befolkning15. Med mye omsorg disse isolerte celler kan opprettholdes i en kultur kolbe eller multi-brønn parabolen. Denne metoden representerer et unikt og kraftig verktøy i studiet av spesifikke neurons og har kapasitet til å isolere levende og funksjonelle celler for videre dyrking.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Under aldringsprosessen, mange celler akkumuleres høye nivåer av skader som fører til cellulær dysfunksjon, som ligger til grunn mange aldersmedisinsk og patologiske tilstander. Post-mitotisk neurons representerer en stor celle type påvirkes av aldring. Selv om flere pattedyr modeller av neuronal aldring eksisterer, er de utfordrende og kostbare å etablere. Den roundworm Caenorhabditis elegans er en kraftfull modell for å studere neuronal aldring, som disse dyrene har kortlevetid, en tilgjengelig robust genetisk verktøykasse, og godt katalogisert nervesystemet. Metoden som presenteres her gir mulighet for sømløs isolering av spesifikke celler basert på uttrykk av et transgene grønt fluorescerende protein (GFP). Transgene Animal Lines uttrykker GFP under distinkte, celle type-spesifikke arrangører er fordøyd å fjerne den ytre cuticle og forsiktig mekanisk forstyrret for å produsere slurry inneholder ulike celletyper. Cellene av interesse blir deretter skilt fra ikke-Target celler gjennom fluorescens-aktivert celle sortering, eller av anti-GFP-sammenkoblede magnetiske perler. De isolerte cellene kan deretter kulturperler i en begrenset periode eller umiddelbart brukes for celle-spesifikke ex vivo analyser som transcriptional analyse av sanntids kvantitativ PCR. Dermed tillater denne protokollen for rask og robust analyse av celle-spesifikke tiltak innenfor ulike neuronal populasjoner i C. elegans.

Protokollen beskrevet her gir mulighet for spesifikk isolering av UNC-17:: GFP-positive kolinerge neurons fra roundworm C. elegans for senere ex vivo studier som celle type-spesifikke genuttrykk profilering og eventuelt kortsiktige dyrking for patch-klemme elektrofysiologi målinger.
Figur 1 viser UNC-17:: GFP-positive kolinerge neurons i sin normale innstilling. UNC-1...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolering av spesifikke Nevron populasjoner fra roundworm Caenorhabditis elegans

Her presenterer vi en protokoll for enkel isolering av spesifikke grupper av levende neuronal celler som uttrykker grønt fluorescerende protein fra transgene Caenorhabditis elegans linjer. Denne metoden gjør det mulig for en rekke ex vivo studier fokusert på spesifikke neurons og har kapasitet til å isolere celler for ytterligere kortsiktige dyrking.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Denne protokollen muliggjør sømløs isolasjon, dyrking og avhør av transkripsjonssvar i en bestemt cellelinje fra C.elegans. Den største fordelen med denne protokollen er det høye nivået av tilpasningsevne til ulike livsstadier av ormer eller bestemte celletyper som skal isoleres. Å demonstrere prosedyren vil være meg selv og Nataliya Zahayko, en tekniker fra laboratoriet vårt.Etter å ha samlet dyrene, sentrifuger dem på 1600 ganger g i fem minutter. Fjern alle de overnaturlige og gjenoppusser ormene i en milliliter M9-medier. Overfør suspensjonen til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Sentrifuge på 1600 ganger g i fem minutter for å pellet ormene. Tilsett deretter 200 mikroliter SDS-DTT-buffer og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Ormene skal nå synes å være rynket langs kroppen hvis de vises under et lett mikroskop.Deretter legger du til 800 mikroliter iskald isolasjonsbuffer og blander ved å sveipe forsiktig røret. Sentrifuge på 13, 000 ganger g og ved fire grader Celsius i ett minutt for å pellet ormene. Fjern supernatant og vask med en milliliter isolasjonsbuffer.Gjenta sentrifugerings- og vaskeprosessen totalt fem ganger, og sørg for å forsiktig fjerne isolasjonsbufferen hver gang. Etter dette, tilsett 100 mikroliter proteaseblanding fra Streptomyces griseus, oppløst i isolasjonsbuffer, til pelleten. Inkuber ved romtemperatur i 10 til 15 minutter, og sørg for å påføre mekanisk forstyrrelse ved å pipetter opp og ned 60 til 70 ganger med en 200 mikropipettespiss mot bunnen av røret.For å bestemme fordøyelsesstadiet, fjern en til fem mikroliter av fordøyelsesblandingen, slipp den på et glasssklie og inspiser det ved hjelp av et vevskulturmikroskop. Etter fem til syv minutter bør ormfragmenter ha en synlig redusert skjellaget og en slurry av celler vil være lett synlig. Stopp reaksjonen ved å legge til 900 mikroliter av kommersielt tilgjengelige Leibovitz's L-15 medium, supplert med 10% FBS og penicillin-streptomycin.Sentrifuge på 10, 000 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter for å pellet isolerte fragmenter og celler. Vask pelleted cellene to ganger mer med kaldt L-15 supplert medium ved hjelp av en milliliter media per vask. Resuspend pelleted cellene i en milliliter av L-15 supplert media, og la på is i 30 minutter.Ta deretter det øverste laget, som er ca 700 til 800 mikroliter, og overføre det til et mikrocentrifugerør. Bruk en automatisert celleteller eller hemacytometer for å måle celletettheten på 10 til 25 mikroliter isolerte celler. Sentrifugeceller fra den isolerte cellesuspensjonen ved 10 000 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter.Kast de supernaturlige og gjenbruke pelleted cellene i L-15 supplert medium til en celle tetthet på ikke mer enn seks millioner celler per milliliter for å unngå overbelastning av strømningscytometeret. Deretter sorterer du celler etter GFP-positivt uttrykk ved hjelp av et strømningscytometer som er i stand til å sortere prøver. GFP-negative celler kan brukes som en kontroll for ikke-celle-type-spesifikk analyse.Etter dette, plate de isolerte cellene i brønnene av en steril seks-brønns plate, plasser platen i en plastbeholder, tilsett en fuktig tørke eller bløtvevpapir for å legge fuktighet til cellene, og inkubere ved 20 grader Celsius. Sentrifugeceller fra den isolerte cellesuspensjonen i et 1,5 milliliter RNase-fritt mikrocentrifugerør ved 10 000 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter. Bruk en mikropipette til å fjerne supernatanten og tilsett 100 mikroliter M9-medium for å vaske bort L-15-supplert medium.Deretter sentrifuger cellene ved 10,000 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter og fjern det overnaturlige. Gjenta denne vaske- og sentrifugeringsprosessen tre ganger totalt for å sikre at alt mediet fjernes, og sørg for å fjerne supernatanten nøye hver gang. Deretter legger du til en milliliter fenol og guanidin isothiocyanatløsning til cellene og pipetter suspensjonen opp og ned forsiktig.Inkuber blandingen ved romtemperatur i fem minutter. Etter dette legger du til 250 mikroliter kloroform og forsiktig inverterer røret 15 til 20 ganger. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter.Sentrifuge på 10, 000 ganger g og ved 25 grader Celsius i fem minutter. Bruk en mikropipette til å forsiktig fjerne så mye av det øverste vandige laget som mulig, og sørg for å ikke forstyrre de nederste organiske lagene. Overfør det nederste laget til et nytt 1,5 milliliter RNase-fritt mikrocentrifugerør.Til det nye røret, tilsett 500 mikroliter isopropanol og bland ved å invertere røret. Inkuber denne løsningen ved romtemperatur i fem minutter. Deretter sentrifuger røret på 14 000 ganger g og ved 25 grader Celsius i 20 minutter.Plasser prøvene på is og bruk en mikropipette for å fjerne så mye isopropanol som mulig. Tilsett forsiktig en milliliter 70% etanol i RNase-fritt dobbeltdestillert vann til røret ved å bruke det på siden av røret. Sentrifuge på 10, 000 ganger g og ved 25 grader Celsius i fem minutter.Fjern det meste av etanol og la røret lufttørke på is i tre til fem minutter. Etter dette legger du til 15 til 20 mikroliter RNase-fritt dobbeltdestillert vann. Bruk et spektrofotometer ved 260 nanometer for å måle RNA-konsentrasjonen og renheten.I denne studien blir unc-17:GFP-positive kolinerge nevroner ekstrahert og isolert fra rundorm C.elegans for påfølgende ex vivo-studier. Unc-17 genet uttrykkes i hele C.elegans kroppen, og koder for en vesikulær acetylkolin transmembrane transportør. Uttrykket av dette genet kan observeres i hode-, mellomkropps- og halenevroner og nevronprojeksjoner.Representative fluorescensmikrografer av unc-17:GFP-positive nevroner etter isolasjon, samt en respektive negativ kontroll fra umodifiserte N2 villtypedyr, vises her. Isolerte celler kan holde seg i live opptil tre dager når de suppleres med Leibovitz's L-15 medium og 10% FBS. Representative data for qPCR fra GFP-uttrykkende kolinerge nevroner, samt GFP-uttrykkende muskelceller, er vist her.Etter vellykket sortering av celler isoleres RNA via en fenol- og guanidinisotyocyanatmetode, hvorav cDNA ble produsert ved hjelp av et syntesesett. Uttrykk for kolinerge nevron-spesifikke gener, tph-1, en tryptofan hydroxylase, og snb-1, en synaptisk vesikkel transportør, er forhøyet i unc-17: GFP isolerte celler. Dette uttrykket finnes imidlertid ikke i myo-3:GFP isolerte celler.Den inverse er sant med uttrykket av muskelspesifikk myosin-tung kjedetranskripsjon av myo-2, da uttrykket av dette genet er begrenset til isolerte muskelceller, men ikke de isolerte kolinerge cellene. Det er viktig å inkubere ormene fullt ut. Imidlertid kan utvidet inkubasjon av ormekaget føre til ormdød eller ekstra stress for dyret.Etter isolasjonen kan cellene enten dyrkes i en periode, eller brukes til RNA-isolasjon og qRT-PCR-analyse. Kultiverte nevroner kan analyseres videre ved patch clamp elektroforese målinger. Denne teknikken kan lette ex vivo analyse av bestemte grupper av celler, og dermed bidra til å forbedre vår forståelse av cellespesifikke svar i sammenheng med flercellede organismer på ulike stadier av livssyklusen.Etter hvert som kjemikalier som SDS og DTT brukes under dette eksperimentet, bør generelle laboratoriesikkerhetsprosedyrer følges mens du lager og bruker buffere.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Helhetlig vurdering av kimbane Chemical Toxicity Bruke Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering av perivaskulær multipotente forløpercelle populasjoner fra humane kardiale Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering av funksjonelle holmer fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdere lysosomale Alkalinization i tarmen Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studere oksidativt Stress forårsaket av Mitis gruppe Streptococci i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropic lys-ark mikroskopi og automatisert Cell Lineage analyser til katalog Caenorhabditis elegans embryogenesis med Subcellulære oppløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Måle sperm veiledning og motilitet innenfor Caenorhabditis elegans Hermafroditt reproduktive tarmkanalen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...