Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Jennifer Fox e aos membros do laboratório Khalimonchuk por comentários perspicazes. Reconhecemos o apoio dos institutos nacionais de saúde (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).

1. preparação e coleta de vermes envelhecidos para isolamento celular
Nota: explicado abaixo é o isolamento de neurônios colinérgicos da linhagem transgênica UNC-17:: GFP (OH13083) obtida do repositório de estirpe Caenorhabditis Genetics Center (CGC) na Universidade de Minnesota. É imperativo manter condições estéreis para evitar a contaminação de fungos ou bactérias.
<ol><li>Prepare e sincronize os vermes através do método de branqueamento conforme descrito...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

A lombriga C. elegans é um modelo bem estabelecido e poderoso para estudar a saúde neuronal e doença2. Com amplas ferramentas genéticas para manipular esses animais e a quantidade gerenciável de vários tipos de neurônio mapeados precisamente, uma grande quantidade de dados pode ser coletada com uma quantia relativamente pequena de material. Aqui, Delineamos um método otimizado para isolar neurônios distintos de animais inteiros. Interrompendo as proteínas da cutícula externa do...

Ao longo das últimas décadas, o modelo metazoários organismo Caenorhabditis elegans tem sido um trunfo tremendo no estudo de neurônios, circuitos neuronais e seu papel em respostas fisiológicas e comportamentais, e envelhecimento associado neurodegenerativa Doenças. Uma característica única de C. elegans é que os animais são transparentes, permitindo que a linhagem de todas as células somáticas adultas seja mapeada1. C. elegans também abriga a quantidade gerenciável de neurônios, levando à morfologia e conectividade do sistema nervoso sendo bem compreendido2. A linhagem de células invariantes, o tempo curto e a abundância de ferramentas genéticas de alta produtividade disponíveis para C. elegans fazem dele um organismo modelo ideal para o estudo do envelhecimento dentro de diferentes populações neuronais.
O envelhecimento dos neurônios e as desordens neurodegenerativas são complexos, e cada desordem tem as assinaturas patológicas originais associadas com ela. No entanto, para muitas dessas desordens, como a doença de Parkinson e de Alzheimer, uma característica comum é a carga progressiva de proteínas desdobradas3,4,5. Em ambas as doenças, as proteínas dobram e agregam dentro da célula para causar toxicidade, levando, em última análise, à morte celular4,5. Para o envelhecimento adequado dos neurônios, a homeostase das mitocôndrias, mais especificamente a homeostase proteica, é importante, pois as perturbações e a distonostase podem levar à neurodegeneração6,7,8. As pilhas são equipadas com os vários mecanismos para manter a homeostase da proteína, uma que é a resposta desdobrado da proteína (UPR) ― uma via clássica onde os sinais do retículo endoplasmático (er) ativam cascatas intracelular do sinal, conduzindo a um transcricional a resposta9. Semelhante a este UPRer, metazoários mostrar uma resposta semelhante à perda de homeostase da proteína mitocondrial, o chamado UPR mitocondrial (UPRMT)7,8. C. elegans parece ser o organismo mais basal para teruma via de elevação confirmada e bem definida do RCQ7.
A função/disfunção de populações neuronais específicas dentro de uma rede maior pode ser difícil de avaliar devido à sua conectividade intrínseca e complexidade3. No entanto, muitas vezes há a necessidade de estudar populações neuronais distintas devido a doenças específicas do tipo celular com patologias complexas, como as associadas à homeostase da proteína celular prejudicada. Em C. elegans, populações neuronais específicas podem ser geneticamente manipuladas permitindo a observação facile in vivo. O sistema nervoso de C. elegans consiste principalmente de neurônios, com uma pequena percentagem de células gliais. Em vermes hermafroditas adultos, existem aproximadamente 302 neurônios, subdivididos em mais de 100 classes diferentes2,10. Neurônios como os neurônios colinérgicos predominam nas junções neuromusculares, enquanto os neurônios dopaminérgicos estão principalmente envolvidos na sensação10,11. Como a atividade motora e as habilidades sensoriais diminuem com a idade, é importante detalhar insights mecanísticos sobre defeitos nesses neurônios individuais11,12. Como tal, há uma necessidade para um método simples e robusto isolar pilhas intactas do interesse para estudos ex vivo subseqüentes.
Aqui, nós descrevemos um método eficaz aperfeiçoado para a isolação rápida de pilhas neuronal específicas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de isolamento pode ser realizado em larvas larvares, juvenis ou adultas. A isolação das pilhas dos sem-fins larval foi publicada previamente por Zhang et al.13 e não será discutida aqui. Uma nota importante aqui é que todos os vermes precisam estar no mesmo estágio de vida para evitar a digestão do animal ou a contaminação de animais em diferentes estágios de vida. Através do rompimento enzimático e mecânico da cutícula do nematódeo, um exoesqueleto alto em colágeno e outras proteínas estruturais, uma grande variedade de células pode ser isolada13,14. As pilhas podem então ser isoladas através da citometria do fluxo ou dos grânulos magnéticos etiquetados anticorpo. Tipicamente, o RNA é isolado através de um método do isotiocianato do phenol e do guanidina para assegurar o enriquecimento da população desejada da pilha15. Com muito cuidado estas pilhas isoladas podem ser mantidas em um balão da cultura ou em um prato do multi-poço. Este método representa uma ferramenta única e poderosa no estudo de neurônios específicos e tem a capacidade de isolar células ao vivo e funcionais para uma maior cultura.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Durante o processo de envelhecimento, muitas células acumulam altos níveis de danos que levam à disfunção celular, que está subjacente a muitas condições geriátricas e patológicas. Os neurônios pós-mitóticos representam um tipo de célula principal afetado pelo envelhecimento. Embora existam vários modelos de mamíferos de envelhecimento neuronal, eles são desafiadores e caros para estabelecer. O lombriga Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para estudar o envelhecimento neuronal, como estes animais têm tempo curto, uma caixa de ferramentas genética robusta disponível, e sistema nervoso bem catalogado. O método aqui apresentado permite a isolação sem emenda de pilhas específicas baseadas na expressão de uma proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Linhas de animais transgênicas expressando GFP distintos, os promotores específicos do tipo celular são digeridos para remover a cutícula externa e suavemente interrompidas mecanicamente para produzir chorume contendo vários tipos de células. As células de interesse são então separadas de células não-alvo através de triagem de células ativadas por fluorescência, ou por anti-GFP-acoplado contas magnéticas. As pilhas isoladas podem então ser cultivadas por um tempo limitado ou ser usadas imediatamente para análises ex vivo Cell-specific tais como a análise transcricional pelo PCR quantitativo do tempo real. Assim, este protocolo permite a análise rápida e robusta de respostas Cell-specific dentro das populações neuronal diferentes em C. elegans.

O protocolo descrito aqui permite o isolamento específico de UNC-17:: neurónios colinérgicos positivos do GFP da lombriga C. elegans para estudos ex vivo subsequentes, tais como perfil de expressão gênica específica do tipo celular e eventual cultivo de curto prazo para medições de eletrofisiologia de patch-Clamp.
A Figura 1 mostra os neurônios colinérgicos UNC-17</em...

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Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Este protocolo permite o isolamento perfeito, a culminação e o interrogatório de respostas transcricionais em uma linhagem celular específica de C.elegans. A principal vantagem deste protocolo é o alto nível de adaptabilidade a diferentes estágios de vida de vermes ou tipos de células específicas a serem isolados. Demonstrando o procedimento seremos eu e Nataliya Zahayko, uma técnica do nosso laboratório.Depois de coletar os animais, centrifuá-los a 1600 vezes g por cinco minutos. Remova todos os supernascentes e resuspense os vermes em um mililitro da mídia M9. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar a 1600 vezes g por cinco minutos para pelotar os vermes. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão SDS-DTT e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Os vermes agora parecem estar enrugados ao longo do corpo se vistos sob um microscópio leve.Em seguida, adicione 800 microliters de tampão de isolamento gelado e misture movendo suavemente o tubo. Centrifugar a 13.000 vezes g e a quatro graus Celsius por um minuto para pelotar os vermes. Remova o supernatante e lave com um mililitro de tampão de isolamento.Repita o processo de centrifugação e lavagem um total de cinco vezes, certificando-se de remover cuidadosamente o tampão de isolamento cada vez. Depois disso, adicione 100 microliters de mistura de protease de Streptomyces griseus, dissolvido em tampão de isolamento, à pelota. Incubar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, certificando-se de aplicar interrupção mecânica ao subir e descer 60 a 70 vezes com uma ponta de micropipette de 200 microliter contra a parte inferior do tubo.Para determinar o estágio da digestão, remova de um a cinco microlitros da mistura de digestão, solte-a em um slide de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura tecidual. Após cinco a sete minutos, fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e um chorume de células será facilmente visível. Pare a reação adicionando 900 microliters do meio L-15 de Leibovitz comercialmente disponível, complementado com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina.Centrífuga a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos para pelotas fragmentos isolados e células. Lave as células pelotas mais duas vezes com mídia l-15 resfriada usando um mililitro de mídia por lavagem. Resuspenda as células pelotas em um mililitro de L-15 de mídia suplementada, e deixe no gelo por 30 minutos.Em seguida, pegue a camada superior, que é aproximadamente 700 a 800 microliters, e transfira-a para um tubo de microcentrifuge. Use um contador celular automatizado ou hemacytómetro para medir a densidade celular de 10 a 25 microliters de células isoladas. Células centrífugas da suspensão celular isolada a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernasal e resuspenque as células pelleted em L-15 complementado médio a uma densidade celular de não mais de seis milhões de células por mililitro para evitar sobrecarregar o citómetro de fluxo. Em seguida, classifique células por expressão GFP-positive usando um citômetro de fluxo capaz de classificar amostras. As células GFP-negativas podem ser usadas como um controle para análises não específicas do tipo celular.Depois disso, coloque as células isoladas nos poços de uma placa estéril de seis poços, coloque a placa em um recipiente plástico, adicione um lenço úmido ou papel de tecido mole para adicionar umidade às células e incubar a 20 graus Celsius. Células centrífugas da suspensão celular isolada em um tubo de microcentrifusagem sem RNase de 1,5 mililitro a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Usando uma micropipette, remova o supernascer e adicione 100 microliters de m9 médio para lavar o meio L-15.Em seguida, centrifugar as células a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos e remover o supernasce. Repita este processo de lavagem e centrifugação três vezes maior para garantir que toda a mídia seja removida, certificando-se de remover cuidadosamente o supernatante cada vez. Em seguida, adicione um mililitro de solução de isothiocianato de fenol e guanidina às células e pipeta a suspensão para cima e para baixo cuidadosamente.Incubar a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois disso, adicione 250 microliters de clorofórmio e inverta suavemente o tubo 15 a 20 vezes. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.Centrifugar a 10.000 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos. Use uma micropipette para remover cuidadosamente o máximo possível da camada aquosa superior, certificando-se de não perturbar as camadas orgânicas inferiores. Transfira a camada inferior para um novo tubo de microcentrifuge sem 1,5 mililitros RNase.Ao novo tubo, adicione 500 microliters de isopropanol e misture invertendo o tubo. Incubar esta solução em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugar o tubo a 14.000 vezes g e a 25 graus Celsius por 20 minutos.Coloque as amostras no gelo e use uma micropipette para remover o máximo de isopropanol possível. Adicione suavemente um mililitro de 70% de etanol na água dupla-destilada sem RNase ao tubo, aplicando-o ao lado do tubo. Centrifugar a 10.000 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos.Retire a maior parte do etanol e deixe o tubo secar no gelo por três a cinco minutos. Depois disso, adicione 15 a 20 microliters de água dupla-destilada sem RNase. Use um espectótmetro a 260 nanômetros para medir a concentração e pureza do RNA.Neste estudo, os neurônios colinérgicos unc-17:GFP positivo são extraídos e isolados da lombriga C.elegans para estudos ex vivo subsequentes. O gene unc-17 é expresso em todo o corpo C.elegans, e códigos para um transporte transmembrano de acetilcolina vesicular. A expressão deste gene pode ser observada em neurônios de cabeça, corpo médio e cauda, e projeções de neurônios.Micrografos representativos de fluorescência de neurônios unc-17:GFP positivo após o isolamento, bem como um respectivo controle negativo de animais selvagens N2 não modificados, são mostrados aqui. As células isoladas podem permanecer vivas até três dias quando suplementadas com o meio L-15 de Leibovitz e 10% FBS. Dados representativos de qPCR de neurônios colinérgicos que expressam GFP, bem como células musculares que expressam GFP, são mostrados aqui.Após a triagem com sucesso das células, o RNA é isolado através de um método de isothiocnato de fenol e guanidina, após o qual o CDNA foi produzido usando um kit de síntese. A expressão de genes específicos de neurônios colinérgicos, tph-1, um hidroxilase triptofano, e snb-1, um transportador de vesícula sináptica, é elevada em células isoladas unc-17:GFP. No entanto, essa expressão não está presente em células isoladas myo-3:GFP.O inverso é verdadeiro com a expressão da transcrição da cadeia de mio-2 específica da minodeira, já que a expressão deste gene é limitada a células musculares isoladas, mas não às células colinérgicas isoladas. É importante incubar os vermes completamente. No entanto, a incubação prolongada da cutícula do verme pode resultar em morte de vermes ou estresse adicional ao animal.Após o isolamento, as células podem ser cultivadas por um período de tempo, ou usadas para isolamento de RNA e análise de qRT-PCR. Neurônios cultivados podem ser analisados por medidas de eletroforese de grampo de remendo. Essa técnica pode facilitar a análise ex vivo de grupos específicos de células, ajudando assim a melhorar nossa compreensão das respostas específicas das células no contexto de organismos multicelulares em vários estágios de seu ciclo de vida.Como produtos químicos como SDS e DTT são usados durante este experimento, os procedimentos gerais de segurança do laboratório devem ser seguidos durante a fabricação e o uso de buffers.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

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Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

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Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...