Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Мы благодарим доктора Дженнифер Фокс и членов лаборатории Халимончука за глубокие комментарии. Мы признаем поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (R01 GM108975 в ОК и T32 GM107001-01A1 до E.M.G.).

1. Подготовка и сбор выдержанного червей для клеточной изоляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Объясняется ниже изоляция холинергических нейронов от трансгенных unc-17::GFP штамм (OH13083) полученные из Caenorhabditis Genetics Center (CGC) деформации репозиторий в Университете Миннесоты. Крайне важно под...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

Круглый червь C. elegans является устоявшейся и мощной моделью для изучения нейронального здоровья и болезни2. С достаточным и генетическим инструментом для манипулирования этими животными и управляемым количеством точно отображенных различных типов нейронов, большое к...

За последние несколько десятилетий, метазоановый модель организма Caenorhabditis elegans был огромный актив в изучении нейронов, нейронных схем и его роль в физиологических и поведенческих реакций, и старение связанных нейродегенеративных Заболеваний. Уникальной особенностью C. elegans является то, что животные прозрачны, что позволяет для линии всех взрослых соматических клеток, которые будут отображены1. C. elegans также гавани управляемое количество нейронов, что приводит к морфологии и подключения нервной системы хорошо понимается2. Инвариантная клеточная линия, короткая продолжительность жизни и обилие высокопроизводительных генетических инструментов, доступных для C. elegans, делают его идеальным модельным организмом для изучения старения в различных нейронных популяциях.
Старение нейронов и нейродегенеративных расстройств являются сложными, и каждое расстройство имеет уникальные патологические подписи, связанные с ним. Однако, для многих из этих расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезни Альцгеймера, общей чертой является прогрессирующая нагрузка неправильно сложенных белков3,4,5. В обоих этих заболеваний, белки неправильно и совокупности в клетке, чтобы вызвать токсичность, в конечном счете, приводит к гибели клеток4,5. Для правильного старения нейронов важен гомеостаз митохондрий, в частности белковый гомеостаз, так каквозмущения и дисхомеостаз могут привести к нейродегенерации 6,7,8. Клетки оснащены различными механизмами для поддержания белка гомеостаза, один из которых разворачивается ответ белка (UPR) - классический путь, где сигналы от эндоплазмического ретикулума (ER) активировать внутриклеточного сигнала каскадов, что приводит к транскрипции ответ9. Сродни этому UPRER, метазоаны отображают аналогичный ответ на потерю митохондриального белка гомеостаза, так называемого митохондриального УПО (UPRmt)7,8. C. elegans, как представляется, наиболее базальный организм, чтобы иметь подтвержденный и четко определенный путь UPRMT 7.
Функция /дисфункция конкретных нейронных популяций в рамках более широкой сети может быть трудно оценить из-за их внутренней связи и сложности3. Тем не менее, часто необходимо изучить различные нейронные популяции из-за клеточных типконкретных заболеваний со сложными патологиями, таких как те, которые связаны с нарушениями клеточного белка гомеостаза. В C. elegans, конкретные нейронные популяции могут быть генетически манипулировать позволяет легкого наблюдения in vivo. Нервная система C. elegans в основном состоит из нейронов, с небольшим процентом глиальных клеток. У взрослых червей гермафродита, Есть около 302 нейронов, подразделяются на более чем 100 различных классов2,10. Нейроны, такие как холинергические нейроны преобладают в нервно-мышечных узлов, в то время как дофаминергические нейроны в первую очередь участвуют в сенсации10,11. Как двигательная активность и сенсорные способности снижаются с возрастом, важно подробно механистические идеи о дефектах в этих отдельных нейронов11,12. Таким образом, существует необходимость в простой и надежный метод для изоляции нетронутых клеток, представляющих интерес для последующих исследований ex vivo.
Здесь мы описываем оптимизированный эффективный метод быстрой изоляции специфических нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок (ГФП) от C. elegans. Этот метод изоляции может быть выполнен на личинки, несовершеннолетних или взрослых червей. Изоляция клеток от личинок червей была ранее опубликована Чжан и др.13 и не будет обсуждаться здесь. Важно отметить, что все черви должны быть на одной стадии жизни, чтобы предотвратить переваривание животных или загрязнения от животных в различных стадиях жизни. Через ферментативные и механические нарушения кутикулы нематод, экзоскелет с высоким содержанием коллагена и других структурных белков, широкий спектр клеток могут быть изолированы13,14. Клетки могут быть изолированы через цитометрию потока или антитела помечены магнитные бусы. Как правило, РНК изолирована с помощью фенола и гуанидина изотиоцианата метод для обеспечения обогащения желаемой популяции клеток15. С большой осторожностью эти изолированные клетки могут быть сохранены в культуре колбу или несколько хорошо блюдо. Этот метод представляет собой уникальный и мощный инструмент в изучении конкретных нейронов и имеет возможность изолировать живые и функциональные клетки для дальнейшего культивирования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

В процессе старения многие клетки накапливают высокий уровень повреждений, приводящих к клеточной дисфункции, которая лежит в основе многих гериатрических и патологических состояний. Постмиотические нейроны представляют собой основной тип клеток, пострадавших от старения. Хотя существует несколько моделей старения нейронов млекопитающих, их установить сложно и дорого. Круглый червь Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения старения нейронов, так как эти животные имеют короткую продолжительность жизни, доступнынадежный генетический инструментарий, и хорошо каталогизированной нервной системы. Представленный в данном случае метод позволяет беспрепятственно осваить конкретные клетки на основе экспрессии трансгенного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Трансгенные линии животных, выражающие GFP под различными, клеточными типами,специфическими промоутерами, усваиваются для удаления внешней кутикулы и мягко нарушаются для производства шлама, содержащего различные типы клеток. Клетки интереса после этого отделены от non-target клеток через флуоресцентно-активированную сортировку клетки, или anti-GFP-соединенными магнитными шариками. Изолированные клетки могут быть культивированы в течение ограниченного времени или немедленно использованы для клеточного анализа ex vivo, таких как транскрипционный анализ количественного ПЦР в реальном времени. Таким образом, этот протокол позволяет быстро и надежный анализ клеточных реакций в различных нейронных популяций в C. elegans.

Протокол, описанный здесь, допускает конкретную изоляцию unc-17::GFP-положительных холинергических нейронов от круглого червя C. elegans для последующих исследований ex vivo, таких как профилирование экспрессии генов типа клеток и в конечном итоге кратковременное куль...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans

Здесь мы представляем протокол для простой изоляции конкретных групп живых нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок из трансгенных линий Caenorhabditis elegans. Этот метод позволяет различные исследования ex vivo сосредоточены на конкретных нейронов и имеет возможность изолировать клетки для дальнейшего краткосрочного культивирования.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Этот протокол позволяет бесшовной изоляции, культивирования и допроса транскрипционных ответов в конкретной линии клеток от C.elegans. Основным преимуществом этого протокола является высокий уровень адаптации к различным стадиям жизни червей или конкретных типов клеток, которые должны быть изолированы. Демонстрацией процедуры будет я и Наталья Захайко, техник из нашей лаборатории.После сбора животных, центрифуга их на 1600 раз г в течение пяти минут. Удалите все супернатанты и повторно помесить червей в один миллилитр M9 средств массовой информации. Перенесите подвеску в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.Центрифуга в 1600 раз г в течение пяти минут, чтобы гранулировать червей. Затем добавьте 200 микролитров буфера SDS-DTT и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Черви теперь должны казаться морщинистыми вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.Далее добавьте 800 микролитров ледяного буфера изоляции и смешайте, аккуратно щелкивая трубку. Центрифуга при 13 000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты, чтобы гранулировать червей. Удалить супернатант и промыть одним миллилитром буфера изоляции.Повторите процесс центрифугации и мытья в общей сложности пять раз, убедившись, что тщательно удалить буфер изоляции каждый раз. После этого добавьте в гранулы 100 микролитров протеазной смеси из Streptomyces griseus, растворенных в буфере изоляции. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут, убедившись, что применять механические нарушения путем трубопроводов вверх и вниз от 60 до 70 раз с 200-микролитер микропипетр кончиком против нижней части трубки.Чтобы определить стадию пищеварения, удалите от одного до пяти микролитров смеси пищеварения, опустите его на стеклянную горку и осмотрите с помощью микроскопа культуры тканей. Через пять-семь минут фрагменты червя должны иметь заметно уменьшенную кутикулу, и навоз клеток будет легко виден. Остановите реакцию, добавив 900 микролитров коммерчески доступных L-15 среды Лейбовица, дополненный 10%FBS и пенициллин-стрептомицин.Центрифуга при 10 000 раз г и при четырех градусах По Цельсию в течение пяти минут гранулировать изолированные фрагменты и клетки. Вымойте гранулы клетки в два раза больше с холодной L-15 дополнительных средств массовой информации с использованием одного миллилитра средств массовой информации на стирку. Переусердуйте гранулы клеток в один миллилитр L-15 дополнительных средств массовой информации, и оставить на льду в течение 30 минут.Затем возьмите верхний слой, который составляет примерно от 700 до 800 микролитров, и перенесите его в трубку микроцентрифуга. Используйте автоматизированный счетчик клеток или гемацитометр для измерения плотности клеток от 10 до 25 микролитров изолированных клеток. Центрифуги клетки из изолированной клеточной суспензии при 10 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.Отбросьте супернатант и будем повторно использовать гранулы клеток L-15, дополнив их плотностью не более шести миллионов клеток на миллилитр, чтобы избежать перегрузки цитометра потока. Затем сортируют клетки по GFP-положительному выражению с помощью цитометра потока, способного сортировать образцы. GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве элемента управления для анализа, не тип клетки.После этого, пластины изолированных клеток в колодцы стерильной пластины шесть скважин, поместите пластину в пластиковый контейнер, добавить влажную салфетку или мягкую бумагу ткани, чтобы добавить влагу в клетки, и инкубировать при 20 градусов по Цельсию. Клетки центрифуги из изолированной клеточной подвески в 1,5-миллилитровой микроцентрифуге без RNase в 10 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Используя микропипют, удалите супернатант и добавьте 100 микролитров среды M9, чтобы смыть L-15 дополненной среды.Затем центрифуга клетки на 10000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут и удалить супернатант. Повторите этот процесс мытья и центрифугации в три раза больше, чтобы убедиться, что все средства массовой информации удаляется, убедившись, что тщательно удалить супернатант каждый раз. Затем добавьте один миллилитр фенола и гуанидина изотиоцианат раствора в клетки и пипетки подвески вверх и вниз тщательно.Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. После этого добавьте 250 микролитров хлороформа и аккуратно инвертировать трубку от 15 до 20 раз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.Центрифуга при 10 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Используйте micropipette тщательно удалить как можно больше верхнего aqueous слой, как это возможно, убедившись, что не беспокоить нижней органических слоев. Перенесите нижний слой в новую микроцентрифугную трубку без 1,5 миллилитров RNase.К новой трубке добавьте 500 микролитров изопропанола и перемешайте трубку. Инкубировать этот раствор при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем центрифуга трубки на 14000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение 20 минут.Поместите образцы на лед и используйте микропипюту, чтобы удалить как можно больше изопропанола. Аккуратно добавьте один миллилитр 70% этанола в RNase-бесплатно двойной дистиллированной воды в трубку, применяя его в сторону трубки. Центрифуга при 10 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.Удалите большую часть этанола и дайте трубке высохнуть на льду в течение трех-пяти минут. После этого добавьте от 15 до 20 микролитров воды без RNase. Используйте спектрофотометр на 260 нанометров для измерения концентрации и чистоты РНК.В этом исследовании, unc-17:GFP-положительные холинергические нейроны извлекаются и изолированы от круглого червя C.elegans для последующих исследований ex vivo. Ген unc-17 выражен по всему телу C.elegans, и коды для везикулярного ацетилхолина трансмембранного транспортера. Выражение этого гена можно наблюдать в головах, середине тела и хвостовых нейронах, а также в проекциях нейронов.Здесь показаны репрезентативные микрографы флуоресценции некон-17:GFP-положительных нейронов после изоляции, а также соответствующий отрицательный контроль со стороны неизмененных животных N2 дикого типа. Изолированные клетки могут оставаться в живых до трех дней, когда дополняется L-15 Лейбовица среднего и 10%FBS. Здесь показаны репрезентативные данные qPCR от GFP-экспрессинг холинергических нейронов, а также GFP-экспрессинговых мышечных клеток.После успешной сортировки клеток РНК изолируются с помощью метода фенола и гуанидина изотиоцианата, после чего кДНК вырабатывается с помощью синтеза. Выражение холинергических нейронов конкретных генов, tph-1, триптофан гидроксилазы, и snb-1, синаптический транспортер пузырьков, поднимается в unc-17:GFP изолированных клеток. Однако это выражение не присутствует в изолированных клетках myo-3:GFP.Обратное верно с выражением мышечно-специфической миозин-тяжелой цепи стенограммы мио-2, так как экспрессия этого гена ограничивается изолированными мышечными клетками, но не изолированными холинергическими клетками. Важно, чтобы инкубировать червей в полном объеме. Однако, расширенная инкубация кутикулы червя может привести к смерти червя или дополнительного стресса для животного.После изоляции, клетки могут быть либо культурны в течение определенного периода времени, или использоваться для изоляции РНК и qRT-PCR анализа. Культурные нейроны могут быть дополнительно проанализированы с помощью измерений электрофорезного зажима патча. Этот метод может облегчить анализ ex vivo конкретных групп клеток, тем самым помогая улучшить наше понимание клеточных реакций в контексте многоклеточных организмов на различных этапах своего жизненного цикла.Поскольку в ходе этого эксперимента используются такие химические вещества, как SDS и DTT, следует соблюдать общие лабораторные процедуры безопасности при создании и использовании буферов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Эффективная изоляция функциональных островках из неонатальной мыши Поджелудочная железа

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Иммобилизация Caenorhabditis elegans для анализа внутриклеточного транспорта в нейроны

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Оценка лизосомальных подщелачивание в кишечнике Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Изучения оксидативного стресса, вызванного стрептококки группы Mitis в Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Измерение сперматозоидов Руководство и подвижность в Caenorhabditis elegans Гермафродит репродуктивного тракта

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...