Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
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Agradecemos a la Dra. Jennifer Fox y a los miembros del laboratorio Khalimonchuk por sus comentarios perspicaces. Reconocemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM108975 a O.K. y T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).

1. Preparación y recolección de gusanos envejecidos para el aislamiento celular
NOTA: A continuación se explica el aislamiento de las neuronas colinérgicas del repositorio transgénico unc-17::GFP (OH13083) obtenido del repositorio de cepas del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) de la Universidad de Minnesota. Es imperativo mantener las condiciones estériles para evitar la contaminación de hongos o bacterias.
<ol><li>Preparar y sincronizar gusanos a través del ...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. 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El gusano redondo C. elegans es un modelo bien establecidoy potente para estudiar la salud neuronal y la enfermedad 2. Con amplias herramientas genéticas para manipular estos animales y una cantidad manejable de varios tipos de neuronas mapeadas con precisión, una gran cantidad de datos se pueden recopilar con una cantidad relativamente pequeña de material. Aquí, delineamos un método optimizado para aislar neuronas distintas de animales enteros. Al interrumpir las proteínas externas...

Durante las últimas décadas, el organismo modelo metazoano Caenorhabditis elegans ha sido un tremendo activo en el estudio de las neuronas, los circuitos neuronales y su papel en las respuestas fisiológicas y conductuales, y el envejecimiento asociado Enfermedades. Una característica única de C. elegans es que los animales son transparentes, lo que permite mapear el linaje de todas las células somáticas adultas1. C. elegans también alberga una cantidad manejable de neuronas, lo que lleva a la morfología y conectividad del sistema nervioso siendo bien entendido2. El linaje celular invariable, la corta vida útil y la abundancia de herramientas genéticas de alto rendimiento disponibles para C. elegans lo convierten en un organismo modelo ideal para el estudio del envejecimiento dentro de diferentes poblaciones neuronales.
El envejecimiento de las neuronas y los trastornos neurodegenerativos son complejos, y cada trastorno tiene firmas patológicas únicas asociadas con él. Sin embargo, para muchos de estos trastornos, como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, una característica común es la carga progresiva de proteínas mal plegadas3,4,5. En ambas enfermedades, las proteínas se multiplican en sí y se agregan dentro de la célula para causar toxicidad, lo que en última instancia conduce a la muerte celular4,5. Para el envejecimiento adecuado de las neuronas, la homeostasis de las mitocondrias, más específicamente la proteica homeostasis, es importante, ya que las perturbaciones y la dishomeostasis pueden conducir a la neurodegeneración6,7,8. Las células están equipadas con varios mecanismos para mantener la homeostasis proteica, una de las que se trata de la respuesta proteica desplegada (UPR), una vía clásica donde las señales del retículo endoplasmático (ER) activan cascadas de señal intracelular, lo que conduce a una transcripción respuesta9. Al igual que este EPUER, los metazoos muestran una respuesta similar a la pérdida de homeostasis de proteína mitocondrial, el llamado EPU mitocondrial (UPRmt)7,8. C. elegans parece ser el organismo más basal para tener una víamt UPR confirmada y bien definida7.
La función/disfunción de poblaciones neuronales específicas dentro de una red más grande puede ser difícil de evaluar debido a su conectividad intrínseca y complejidad3. Sin embargo, a menudo es necesario estudiar poblaciones neuronales distintas debido a enfermedades específicas del tipo celular con patologías complejas, como las asociadas con la homeostasis de proteínas celulares deterioradas. En C. elegans, poblaciones neuronales específicas pueden ser manipuladas genéticamente permitiendo la observación fácil in vivo. El sistema nervioso de C. elegans consiste principalmente en neuronas, con un pequeño porcentaje de células gliales. En los gusanos hermafroditas adultos, hay aproximadamente 302 neuronas, subdivididas en más de 100 clases diferentes2,10. Las neuronas como las neuronas colinérgicas predominan en las uniones neuromusculares, mientras que las neuronas dopaminérgicas están implicadas principalmente en la sensación10,11. Como tanto la actividad motora como las capacidades sensoriales disminuyen con la edad, es importante detallar los conocimientos mecanicistas sobre los defectos en estas neuronas individuales11,12. Como tal, es necesario un método simple y robusto para aislar las células intactas de interés para estudios ex vivo posteriores.
Aquí, describimos un método eficaz optimizado para el aislamiento rápido de células neuronales específicas que expresan proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de aislamiento se puede realizar en gusanos larvarios, juveniles o adultos. El aislamiento de las células de los gusanos larvarias fue publicado previamente por Zhang et al.13 y no se discutirá aquí. Una nota importante aquí es que todos los gusanos deben estar en la misma etapa de la vida para evitar la digestión excesiva del animal o la contaminación de los animales en diferentes etapas de la vida. A través de la interrupción enzimática y mecánica de la cutícula de nematodos, un exoesqueleto alto en colágeno y otras proteínas estructurales, una amplia variedad de células se puede aislar13,14. Las células se pueden aislar a través de citometría de flujo o anticuerpos etiquetados como cuentas magnéticas. Típicamente, el ARN se aísla a través de un método de isotiocianato de fenol y guanidina para asegurar el enriquecimiento de la población celular deseada15. Con mucho cuidado, estas células aisladas se pueden mantener en un matraz de cultivo o en un plato multipozo. Este método representa una herramienta única y poderosa en el estudio de neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar células vivas y funcionales para un cultivo posterior.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Durante el proceso de envejecimiento, muchas células acumulan altos niveles de daño que conducen a la disfunción celular, que subyace en muchas condiciones geriátricas y patológicas. Las neuronas postmitoticas representan un tipo de célula principal afectada por el envejecimiento. Aunque existen múltiples modelos de mamíferos de envejecimiento neuronal, son desafiantes y costosos de establecer. El gusano redondo Caenorhabditis elegans es un modelo potente para estudiar el envejecimiento neuronal, ya que estos animales tienen una vida útil corta, una caja de herramientas genética robusta disponible y un sistema nervioso bien catalogado. El método presentado aquí permite el aislamiento sin fisuras de células específicas basado en la expresión de una proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Las líneas animales transgénicas que expresan GFP bajo promotores distintos específicos del tipo de célula se digieren para eliminar la cutícula externa y se interrumpen mecánicamente para producir lodos que contienen varios tipos de células. Las células de interés se separan de las células no objetivo mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, o por cuentas magnéticas acopladas anti-GFP. Las células aisladas pueden ser cultivadas por un tiempo limitado o inmediatamente utilizadas para análisis ex vivo específicos de células, como el análisis transcripcional por PCR cuantitativo en tiempo real. Por lo tanto, este protocolo permite un análisis rápido y robusto de las respuestas específicas de las células dentro de diferentes poblaciones neuronales en C. elegans.

El protocolo descrito aquí permite el aislamiento específico de las neuronas colinérgicas unc-17::GFP-positivas de la tiña C. elegans para estudios ex vivo posteriores, como el perfil de expresión génica específico del tipo de célula y cultivo a corto plazo para mediciones de electrofisiología de abrazadera de parche.
Figura 1 muestra unc-17::GFP-neuronas colinér...

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Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento simple de grupos específicos de células neuronales vivas que expresan proteína fluorescente verde de líneas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Este método permite una variedad de estudios ex vivo centrados en neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar las células para el cultivo a corto plazo.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Este protocolo permite el aislamiento, el cultivo y el interrogatorio sin fisuras de las respuestas transcripcionales en un linaje celular específico de C.elegans. La principal ventaja de este protocolo es el alto nivel de adaptabilidad a diferentes etapas de vida de gusanos o tipos de células específicos que se van a aislar. Demostrando el procedimiento seremos Nataliya Zahayko y yo, una técnico de nuestro laboratorio.Después de recoger los animales, centrifugarlos a 1600 veces g durante cinco minutos. Retire todo el sobrenadante y resusppend los gusanos en un mililitro de medios M9. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar a 1600 veces g durante cinco minutos para peletizar los gusanos. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón SDS-TDT e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Los gusanos ahora deben parecer arrugados a lo largo del cuerpo si se ven bajo un microscopio de luz.A continuación, agregue 800 microlitros de tampón de aislamiento frío y mezcle moviendo suavemente el tubo. Centrifugar a 13.000 g y a cuatro grados celsius durante un minuto para hacer pellets de los gusanos. Retire el sobrenadante y lávelo con un mililitro de tampón de aislamiento.Repita la centrifugación y el proceso de lavado un total de cinco veces, asegurándose de retirar cuidadosamente el búfer de aislamiento cada vez. Después de esto, añadir 100 microlitros de la mezcla de proteasa de Streptomyces griseus, disuelto en tampón de aislamiento, al pellet. Incubar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, asegurándose de aplicar la interrupción mecánica pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 60 a 70 veces con una punta de micropipeta de 200 microlitrólitros contra la parte inferior del tubo.Para determinar la etapa de digestión, retire de uno a cinco microlitros de la mezcla de digestión, suéltelo en un portaobjetos de vidrio e inspeccione con un microscopio de cultivo de tejido. Después de cinco a siete minutos, los fragmentos de gusano deben tener una cutícula visiblemente reducida y una suspensión de las células será fácilmente visible. Detenga la reacción añadiendo 900 microlitros del medio L-15 de Leibovitz disponible comercialmente, complementado con 10%FBS y penicilina-estreptomicina.Centrifugar a 10.000 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para peletizar fragmentos aislados y células. Lavar las células peletadas dos veces más con medios fríos L-15 suplementados usando un mililitro de medios por lavado. Resuspender las células peletadas en un mililitro de L-15 medios suplementados, y dejar en hielo durante 30 minutos.A continuación, tome la capa superior, que es aproximadamente 700 a 800 microlitros, y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Utilice un contador de células automatizado o hemacytómetro para medir la densidad celular de 10 a 25 microlitros de células aisladas. Células centrífugas de la suspensión celular aislada a 10.000 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y resusppend las células peletadas en L-15 suplementada media a una densidad celular de no más de seis millones de células por mililitro para evitar sobrecargar el citómetro de flujo. A continuación, ordene las células por expresión GFP positiva utilizando un citómetro de flujo capaz de ordenar muestras. Las celdas negativas GFP se pueden utilizar como control para el análisis no específico del tipo de celda.Después de esto, plato las células aisladas en los pozos de una placa estéril de seis pozos, colocar la placa en un recipiente de plástico, añadir una toallita húmeda o papel de tejido suave para agregar humedad a las células, e incubar a 20 grados Celsius. Células centrífugas de la suspensión celular aislada en un tubo de microcentrífuga sin RNase de 1,5 mililitros a 10.000 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Con una micropipeta, retire el sobrenadante y añada 100 microlitros de M9 medium para lavar el medio suplementado L-15.A continuación, centrifugar las células a 10.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y retire el sobrenadante. Repita este proceso de lavado y centrifugación tres veces en total para asegurarse de que se retiran todos los medios, asegurándose de retirar cuidadosamente el sobrenadante cada vez. Luego, agregue un mililitro de solución de isotiocianato de fenol y guanidina a las células y pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo con cuidado.Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de esto, agregue 250 microlitros de cloroformo e invierta suavemente el tubo de 15 a 20 veces. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Centrifugar a 10.000 g y a 25 grados centígrados durante cinco minutos. Utilice una micropipeta para eliminar cuidadosamente la mayor parte de la capa acuosa superior como sea posible, asegurándose de no perturbar las capas orgánicas inferiores. Transfiera la capa inferior a un nuevo tubo de microcentrífuga sin RNase de 1,5 mililitros.Al nuevo tubo, añadir 500 microlitros de isopropanol y mezclar invirtiendo el tubo. Incubar esta solución a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego centrifuga el tubo a 14.000 veces g y a 25 grados centígrados durante 20 minutos.Coloque las muestras sobre hielo y utilice una micropipeta para eliminar la mayor cantidad posible de isopropanol. Agregue suavemente un mililitro de 70% de etanol en agua doble destilada sin RNase al tubo aplicándolo en el lado del tubo. Centrifugar a 10.000 g y a 25 grados centígrados durante cinco minutos.Retire la mayor parte del etanol y deje que el tubo se seque al aire sobre hielo durante tres a cinco minutos. Después de esto, agregue de 15 a 20 microlitros de agua doble destilada sin RNase. Utilice un espectrofotómetro a 260 nanómetros para medir la concentración y pureza del ARN.En este estudio, unc-17:GFP-positiva neuronas colinérgicas se extraen y se aíslan de la lombriz redonda C.elegans para estudios ex vivo posteriores. El gen unc-17 se expresa en todo el cuerpo de C.elegans, y codifica para un transportador de transmembrana de acetilcolina vesicular. La expresión de este gen se puede observar en la cabeza, el cuerpo medio, y las neuronas de cola, y las proyecciones de neuronas.Aquí se muestran micrografías representativas de fluorescencia representativas de las neuronas unc-17:GFP positivas después del aislamiento, así como un control negativo respectivo de animales salvajes N2 no modificados. Las células aisladas pueden permanecer vivas hasta tres días cuando se complementan con L-15 medio de Leibovitz y 10%FBS. Aquí se muestran datos representativos de qPCR de neuronas colinérgicas que expresan GFP, así como células musculares que expresan GFP.Después de clasificar con éxito las células, el ARN se aísla a través de un método de isotiocianato de fenol y guanidina, después de lo cual se produjo el ADNr utilizando un kit de síntesis. Expresión de genes específicos de la neurona colinérgica, tph-1, una hidroxilasa triptófano, y snb-1, un transportador de vesículas sinápticas, se eleva en unc-17:GFP células aisladas. Sin embargo, esta expresión no está presente en las células aisladas de myo-3:GFP.Lo inverso es cierto con la expresión de la transcripción de cadena pesada de miosina específica del músculo de myo-2, ya que la expresión de este gen se limita a las células musculares aisladas, pero no a las células colinérgicas aisladas. Es importante incubar los gusanos completamente. Sin embargo, la incubación prolongada de la cutícula del gusano puede resultar en la muerte del gusano o estrés adicional para el animal.Después del aislamiento, las células pueden ser cultivadas durante un período de tiempo, o utilizar para el aislamiento de ARN y el análisis qRT-PCR. Las neuronas cultivadas se pueden analizar más a fondo mediante mediciones de electroforesis de abrazadera de parche. Esta técnica podría facilitar el análisis ex vivo de grupos específicos de células, ayudando así a mejorar nuestra comprensión de las respuestas específicas de las células en el contexto de organismos multicelulares en varias etapas de su ciclo de vida.Como los productos químicos como SDS y TDT se utilizan durante este experimento, se deben seguir los procedimientos generales de seguridad de laboratorio durante la fabricación y el uso de tampones.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Investigación

Biología del Desarrollo

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Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...