Name: isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi tackar Dr Jennifer Fox och medlemmarna i Khalimonchuk laboratorium för insiktsfulla kommentarer. Vi erkänner stödet från National Institutes of Health (R01 GM108975 to OK och T32 GM107001-01A1 till E.M.G.).

1. beredning och insamling av åldrade maskar för cell isolering
Obs: förklaras nedan är isoleringen av kolinerga neuroner från transgena UNC-17:: GFP stam (OH13083) erhålls från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) stam förvaret vid University of Minnesota. Det är absolut nödvändigt att bibehålla sterila förhållanden för att förhindra kontaminering från svampar eller bakterier.
<ol><li>Förbered och synkronisera maskar via blekning metod som beskrivs av T. ...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+The+examples+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li><li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer&#8217;s+and+Parkinson&#8217;s+disease.">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li><li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates.">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li><li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+UPR:+mechanisms,+physiological+functions+and+implications.">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li><li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans.">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li><li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfolded+protein+response:+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation.">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li><li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron+aging:+learning+from+C.+elegans.">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li><li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis.">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).</li><li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones.">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans.">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432 (2015).</li></ol>

Rundmask C. elegans är en väletablerad och kraftfull modell för att studera neuronala hälsa och sjukdom2. Med rikliga genetiska verktyg för att manipulera dessa djur och hanterbar mängd exakt kartlagt olika neuron typer, en hel del data kan samlas in med en relativt liten mängd material. Här skisserar vi en optimerad metod för att isolera distinkta neuroner från hela djur. Genom att störa maskens yttre nagelband proteiner, kan en flytgödsel av olika celltyper isoleras, inklusi...

Under de senaste decennierna, den metazoan modellorganism Caenorhabditis elegans har varit en enorm tillgång i studien av nervceller, neuronala kretsar och dess roll i fysiologiska och beteendemässiga svar, och åldrande-associerade neurodegenerativa Sjukdomar. En unik egenskap hos C. elegans är att djuren är transparenta, så att härstamning av alla vuxna somatiska celler mappas1. C. elegans hamnar också hanterbar mängd av nervceller, vilket leder till morfologi och konnektivitet av nervsystemet är väl förstått2. Den invariant cell härstamning, kort livslängd, och överflöd av hög genomströmning genetiska verktyg tillgängliga för C. elegans gör det till en idealisk modell organism för studiet av åldrande inom olika neuronala populationer.
Åldrande av nervceller och neurodegenerativa sjukdomar är komplexa, och varje störning har unika patologiska signaturer i samband med det. Men för många av dessa sjukdomar, såsom Parkinsons och Alzheimers sjukdom, en gemensam funktion är den progressiva belastningen av felvikt proteiner3,4,5. I båda dessa sjukdomar, proteiner misfold och aggregera inom cellen att orsaka toxicitet, i slutändan leder till celldöd4,5. För korrekt åldrande av nervceller, homeostasen av mitokonen, mer specifikt protein homeostas, är viktigt, eftersom störningar och dyshomeostasis kan leda till neurodegeneration6,7,8. Celler är utrustade med olika mekanismer för att upprätthålla protein homeostas, en är den ovikt protein svar (UPR) ― en klassisk väg där signaler från endoplasmatiska Retikulum (ER) Aktivera intracellulära signal kaskader, vilket leder till en transkriptionell svar9. Besläktad med denna UPRer, metazoer uppvisar ett liknande svar på förlust av mitokondriellt protein homeostas, den så kallade mitokondrie UPR (UPRMT)7,8. C. elegans verkar vara den mest basala organismen för att ha en bekräftad och VÄLDEFINIERAD UPRMT -väg7.
Funktionen/dysfunktion av specifika neuronala populationer inom ett större nätverk kan vara svårt att bedöma på grund av deras inneboende anslutning och komplexitet3. Emellertid, det finns ofta ett behov av att studera distinkta neuronala populationer på grund av celltyp-specifika sjukdomar med komplexa patologier, såsom de associerade med nedsatt cellulära protein homeostas. I C. eleganskan specifika neuronala populationer vara genetiskt manipulerade vilket möjliggör facile observation in vivo. Nervsystemet i C. elegans består främst av nervceller, med en liten andel av gliaceller. I vuxna hermafrodit maskar, det finns cirka 302 neuroner, indelade i över 100 olika klasser2,10. Nervceller såsom kolinerga neuroner dominerar i neuromuskulära korsningar, medan dopaminerga neuroner är främst involverade i sensation10,11. Eftersom både motorisk aktivitet och sensoriska förmågor avtar med åldern, är det viktigt att detaljera mekanistiska insikter om defekter i dessa enskilda nervceller11,12. Som sådan, det finns ett behov av en enkel och robust metod för att isolera intakt celler av intresse för efterföljande ex vivo studier.
Här beskriver vi en optimerad effektiv metod för snabb isolering av specifika neuronala celler som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) från C. elegans. Denna isoleringsmetod kan utföras på larver, juvenila eller vuxna maskar. Isolering av celler från larv maskar har tidigare publicerats av Zhang et al.13 och kommer inte att diskuteras här. En viktig anmärkning här är att alla maskar måste vara på samma livsskede för att förhindra övernedbrytning av djuret eller kontaminering från djur i olika livsskeden. Genom både enzymatiska och mekaniska störningar av nematodnagelbanden, ett exoskelett högt i kollagen och andra strukturella proteiner, kan en mängd olika celler isoleras13,14. Celler kan sedan isoleras via flödescytometri eller antikropp märkta magnetiska pärlor. Typiskt, RNA isoleras via en fenol och guanidin isotiocyanate metod för att säkerställa berikning av önskad cellpopulation15. Med mycket omsorg dessa isolerade celler kan upprätthållas i en kulturkolv eller multi-well skålen. Denna metod är ett unikt och kraftfullt verktyg i studiet av specifika nervceller och har kapacitet att isolera levande och funktionella celler för vidare odling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Molecular Biology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>496189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>D8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professionals</td>
			<td>7552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>M2090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S5199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>X190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl (Bleach)</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Y</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>P3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7433</td>
			<td>protease mixture from Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>O227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>S8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step synthesis kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>phenol and guanidine isothiocyanate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10Z82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-GFP magnetic beads</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of specific neuron populations from roundworm caenorhabditis elegans

Under åldrandet, många celler ackumuleras höga nivåer av skador som leder till cellulära dysfunktion, som ligger bakom många geriatriska och patologiska tillstånd. Post-mitotiska neuroner representerar en stor celltyp påverkas av åldrande. Även om flera däggdjurs modeller av neuronala åldrande finns, de är utmanande och dyra att etablera. Spolmasken Caenorhabditis elegans är en kraftfull modell för att studera neuronala åldrande, eftersom dessa djur har kort livslängd, en tillgänglig robust genetisk verktygslåda, och väl katalogiserade nervsystemet. Den metod som presenteras häri möjliggör sömlös isolering av specifika celler baserat på uttrycket av en transgen grönt fluorescerande protein (GFP). Transgena djurlinjer som uttrycker GFP under distinkta, celltyp-specifika initiativtagare bryts ned för att avlägsna den yttre nagelbanden och försiktigt mekaniskt störs för att producera flytgödsel som innehåller olika celltyper. Cellerna av intresse separeras sedan från icke-målceller genom fluorescensaktiverad cell sortering, eller av anti-GFP-kopplade magnetiska pärlor. De isolerade cellerna kan sedan odlas under en begränsad tid eller omedelbart användas för cellspecifika ex vivo-analyser såsom transkriptionell analys av kvantitativ PCR i realtid. Därmed möjliggör detta protokoll en snabb och robust analys av cellspecifika reaktioner inom olika neuronala populationer i C. elegans.

Det protokoll som beskrivs här tillåter specifik isolering av UNC-17:: GFP-positiva kolinerga neuroner från spolmasken C. elegans för efterföljande ex vivo-studier som celltypspecifik gen uttrycks profilering och eventuell kortsiktig kulturering för mätningar med patch-Clamp elektrofysiologi.
Figur 1 visar UNC-17:: GFP-positiva kolinerga neuroner i sin normala inst?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolering av specifika neuron populationer från spolmask Caenorhabditis elegans

Här presenterar vi ett protokoll för enkel isolering av specifika grupper av levande neuronala celler som uttrycker grönt fluorescerande protein från transgena Caenorhabditis elegans linjer. Denna metod möjliggör en mängd olika ex vivo studier fokuserade på specifika nervceller och har kapacitet att isolera celler för ytterligare kortsiktig odling.

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Detta protokoll möjliggör sömlös isolering, odling och förhör av transkriptionella svar i en specifik cell härstamning från C.elegans. Den största fördelen med detta protokoll är den höga nivån av anpassningsförmåga till olika livsstadium av maskar eller specifika celltyper som ska isoleras. Demonstrera förfarandet kommer att vara jag och Nataliya Zahayko, en tekniker från vårt laboratorium.Efter att ha samlat djuren centrifuger dem på 1600 gånger g i fem minuter. Ta bort alla supernatant och resuspend maskarna i en milliliter av M9 media. Överför suspensionen till ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör.Centrifugera vid 1600 gånger g i fem minuter för att pelleta maskarna. Tillsätt sedan 200 mikroliter SDS-DTT buffert och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Maskarna bör nu verkar vara skrynkliga längs kroppen om de ses under ett ljusmikroskop.Därefter lägger du till 800 mikroliter av iskall isoleringsbuffert och blanda genom att försiktigt snärta röret. Centrifugera vid 13, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i en minut för att pelleta maskarna. Ta bort supernatanten och tvätta med en milliliter isoleringsbuffert.Upprepa centrifugeringen och tvättprocessen totalt fem gånger, se till att försiktigt ta bort isoleringsbufferten varje gång. Efter detta, tillsätt 100 mikroliter av proteas blandning från Streptomyces griseus, upplöst i isoleringsbuffert, till pelleten. Inkubera i rumstemperatur i 10 till 15 minuter, se till att tillämpa mekaniska störningar genom pipettering upp och ner 60 till 70 gånger med en 200-mikroliter mikropipette spets mot botten av röret.För att bestämma stadiet av matsmältningen, ta bort en till fem mikroliter av matsmältningsblandningen, släpp den på en glasrutschbana och inspektera den med hjälp av ett vävnadsodlingsmikroskop. Efter fem till sju minuter bör maskfragment ha en synbart reducerad nagelband och en slurry av celler kommer att vara lätt synlig. Stoppa reaktionen genom att lägga till 900 mikroliter av kommersiellt tillgängliga Leibovitz's L-15 medium, kompletterad med 10%FBS och penicillin-streptomycin.Centrifugera vid 10, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter till pellet isolerade fragment och celler. Tvätta de pelleterade cellerna två gånger till med kalla L-15 kompletterade medier med hjälp av en milliliter media per tvätt. Resuspend de pelleterade cellerna i en milliliter av L-15 kompletterade media, och låt på is i 30 minuter.Ta sedan det översta lagret, som är ungefär 700 till 800 mikroliter, och överför det till ett mikrocentrifugrör. Använd en automatiserad cellräknare eller hemacytometer för att mäta celltätheten hos 10 till 25 mikroliterceller av isolerade celler. Centrifugceller från den isolerade cellupphängningen vid 10, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter.Kassera supernatanten och resuspend de pelleterade cellerna i L-15 kompletterat medium till en celltäthet av högst sex miljoner celler per milliliter för att undvika att överbelasta flödescytometern. Sortera sedan celler efter GFP-positivt uttryck med hjälp av en flödescytometer som kan sortera prover. GFP-negativa celler kan användas som en kontroll för icke-cell-typ-specifik analys.Efter detta, platta de isolerade cellerna i brunnarna i en steril sex-väl platta, placera plattan i en plastbehållare, tillsätt en fuktig torka eller mjukdelar papper för att lägga fukt till cellerna, och inkubera vid 20 grader Celsius. Centrifugceller från den isolerade cellupphängningen i ett 1,5 milliliter RNase-fritt mikrocentrifugrör vid 10, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Med hjälp av en mikropipette, ta bort supernatanten och tillsätt 100 mikroliter M9 medium för att tvätta bort L-15 kompletterat medium.Därefter centrifugcellerna vid 10 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i fem minuter och ta bort supernatanten. Upprepa denna tvätt- och centrifugeringsprocess tre gånger totalt för att säkerställa att alla medier tas bort, se till att försiktigt ta bort supernatanten varje gång. Tillsätt sedan en milliliter fenol och guanidinisothiocyanate lösning på cellerna och pipettera suspensionen upp och ner försiktigt.Inkubera blandningen i rumstemperatur i fem minuter. Efter detta, tillsätt 250 mikroliter av kloroform och försiktigt invertera röret 15 till 20 gånger. Inkubera i rumstemperatur i fem minuter.Centrifugera vid 10, 000 gånger g och vid 25 grader Celsius i fem minuter. Använd en mikropipette för att försiktigt ta bort så mycket av det övre vattenhaltiga lagret som möjligt, se till att inte störa botten organiska lager. Överför bottenlagret till ett nytt 1,5 milliliter RNase-fritt mikrocentrifugrör.Till det nya röret, tillsätt 500 mikroliter isopropanol och blanda genom att invertera röret. Inkubera denna lösning i rumstemperatur i fem minuter. Sedan centrifugera röret vid 14, 000 gånger g och vid 25 grader Celsius i 20 minuter.Placera proverna på is och använd en mikropipette för att avlägsna så mycket isopropanol som möjligt. Tillsätt försiktigt en milliliter av 70%etanol i RNase-fritt dubbeldestillerat vatten till röret genom att applicera det på sidan av röret. Centrifugera vid 10, 000 gånger g och vid 25 grader Celsius i fem minuter.Ta bort det mesta av etanol och låt röret lufttorka på is i tre till fem minuter. Efter detta, tillsätt 15 till 20 mikroliter RNase-fri dubbeldestillerat vatten. Använd en spektrofotometer vid 260 nanometer för att mäta RNA-koncentrationen och renheten.I denna studie, unc-17:GFP-positiva kolinerga nervceller extraheras och isoleras från rundmasken C.elegans för efterföljande ex vivo studier. Unc-17 genen uttrycks i hela C.elegans kroppen, och koder för en vesikulär acetylkolin transmembrane transportör. Uttrycket av denna gen kan observeras i huvudet, mellankropp, och svans nervceller, och neuron prognoser.Representativa fluorescensmikrografer av unc-17:GFP-positiva nervceller efter isolering, samt en respektive negativ kontroll från omodifierade N2 vilda typ djur, visas här. Isolerade celler kan hålla sig vid liv upp till tre dagar när de kompletteras med Leibovitz's L-15 medium och 10%FBS. Representativa data av qPCR från GFP-uttrycker kolinerga nervceller, samt GFP-uttrycker muskelceller, visas här.Efter att framgångsrikt sortera celler, är RNA isoleras via en fenol och guanidine isothiocyanate metod, varefter cDNA producerades med hjälp av en syntes kit. Expression av kolinerga neuron-specifika gener, tph-1, en tryptofan hydroxylas, och snb-1, en synaptisk vesikel transportör, är förhöjd i UNC-17:GFP isolerade celler. Detta uttryck är dock inte närvarande i myo-3:GFP isolerade celler.Inversen är sann med uttrycket av muskel-specifika myosin-tunga kedjan avskrift av myo-2, som uttryck för denna gen är begränsad till isolerade muskelceller, men inte de isolerade kolinerga cellerna. Det är viktigt att inkubera maskarna fullt ut. Utökad inkubation av maskens nagelband kan dock resultera i maskdöd eller ytterligare stress för djuret.Efter isoleringen kan cellerna antingen odlas under en tid, eller användas för RNA-isolering och qRT-PCR-analys. Odlade nervceller kan analyseras ytterligare av patch clamp elektrofores mätningar. Denna teknik kan underlätta ex vivo analys av specifika grupper av celler, vilket bidrar till att förbättra vår förståelse av cell-specifika svar i samband med flercelliga organismer i olika stadier av sin livscykel.Som kemikalier som SDS och DTT används under detta experiment, bör allmänna lab säkerhetsrutiner följas samtidigt som man gör och använder buffertar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattande Bedömning av nedärvda Kemisk toxicitet Använda Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Isolering av perivaskulär multi Precursor cellpopulationer från Human hjärtvävnad

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv isolering av funktionella cellöar från nyfödda mus bukspottkörteln

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Bedömningen av lysosomala alkalisering i tarmen av Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Studera oxidativ Stress orsakad av den Mitis gruppen streptokocker i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Mätning av spermie vägledning och motilitet inom Caenorhabditis elegans hermaphrodite reproduktions organen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...