Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

我们感谢B.Spee慷慨地提供LD540。这项工作得到了荷兰科学研究组织赠款的支持。VIDI 016.146.353） 到 S.M.

本文描述的所有使用人体组织的实验均获得乌得勒支大学医学中心（UMCU）伦理委员会的批准。在威廉米纳儿童医院（WKZ）-UMCU，获得患者对组织收集、生成、储存和使用组织的知情同意。
1. 文化媒体的筹备
注：此协议应在生物安全柜内执行。器官应按照标准细胞培养指南进行处理。
<ol><li>准备基础培养基。 注：没有生长因?...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

在这里，我们提供一个协议，以确定在用油酸孵育时人类肠道器官的LD形成。该方法基于LD特异性荧光染料LD54018，它允许在有机体培养物内对脂液滴的总体积进行表征和定量。建立和维持人类肠道器官培养的程序已于13日前公布，并可提供该协议的视觉指南以及15。
该协议的关键步骤是人体肠道器官的培养，以及OA与BSA的适...

脂质是人类饮食的重要组成部分，在系统能量储存和代谢中起着重要的作用。摄入时，膳食脂质通过胰腺脂肪酶降解为游离脂肪酸（FFA）和单甘油酯（MGs）。这些基质然后由肠道上皮的肠细胞吸收，它们首先通过单甘油酯丙酸酶（MGAT）酶重新酯化为二甘油酯（DG），然后通过二乙醇对甘油三酯（TG）进行再酯化乙酰转移酶 1 （DGAT1）1.最后，这些TG被集成到用于出口到淋巴系统的奇洛微米或细胞体脂滴（LDs）用于细胞内存储2，3。虽然需要血小微子将膳食脂质分给其他器官，但细胞内脂肪储存在LD中的重要性并不完全清楚。然而，LDs已被证明在肠道中执行调节功能，因为它们在餐4后缓慢释放脂质到循环16小时。此外，LD已被证明可以防止有毒脂肪酸浓度，如在脂肪条件5小鼠脂肪细胞中。
DGAT1蛋白位于内质视网膜（ER）膜上，在肠道上皮的LD形成中起着至关重要的作用。DGAT1 中的同源突变导致早发性严重腹泻和/或呕吐、低白蛋白血症和/或（致命）蛋白质损失的肠病，在脂肪摄入时出现肠道衰竭，说明 DGAT1 在人体脂质平衡中的重要性肠道上皮6，7，8，9，10。由于DGAT1缺乏症很少发生在人类身上，因此很少获得原发性患者衍生的细胞。此外，肠道上皮细胞的长期培养长期仅限于肿瘤衍生的细胞系，这些细胞系只代表正常生理。因此，DGAT1介导LD的形成主要研究在成纤维细胞或动物源细胞系7，10，11，12。因此，最近显示，DGAT1缺乏患者衍生成纤维细胞积累较少的LD与健康控制细胞在刺激后用油酸（OA）8。
以前，建立协议，培养从任何胃肠道器官的上皮干细胞的形式三维（3D）有机体13。这些肠道器官可以长期保存在培养中13，并允许功能研究患者和肠道位置特异性上皮特征14。它们是遗传和表观稳定的，可以储存，允许长期扩张和生物库13。
我们最近证明，LD形成可以很容易地在人体肠道器官在LD形成（LDF）测定6中测量。当暴露于OA16小时，有机体产生LD，以保护细胞免受脂质引起的毒性。当OA浓度过高时，细胞通过卡巴塞介导凋亡6死亡。LDF测定先前证明主要依赖于DGAT1，如从DGAT1突变患者中提取的有机体以及使用DGAT1特异性抑制剂6所指示的。
对于此处详细描述的 LDF 测定，3D 有机体通过肠道活检培养，每周通过中断进入容易形成新有机物的单细胞。为了运行LDF测定，在24孔板的每个孔中镀有7，500个有机物衍生的单细胞。有机体在几天内形成，用1mM OA孵育过夜，并沾染LD540，一种荧光细胞渗透LD特异性染料，便于成像。然后，通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞仪对 LD 形成进行量化。
通过将此 LD 形成测定扩展至 96 井格式，该测定还可用于 LD 结型的高通量分析，以筛选影响人类肠道器官培养中 LD 形成的新药物，或研究影响 （人类遗传） 疾病LD 代谢。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

膳食脂质被肠道上皮作为游离脂肪酸（FAs）。这些FA在细胞内转化为甘油三酯（TG）分子，然后被包装成胆小微子，以输送到淋巴或细胞体脂液滴（LDs），用于细胞内储存。在TG合成的最后一步中，二乙二醇丙酸酶（DGAT）的催化活性是LD的形成的关键步骤。LD对缓冲有毒脂质物种和调节不同细胞类型的细胞代谢非常重要。由于人类肠道上皮经常面临高浓度的脂质，LD形成对于调节平衡非常重要。在这里，我们描述了一个简单的测定，在人类肠道有机体中最常见的不饱和脂肪酸（油酸）刺激时，对LD形成（LDF）的表征和定量。LDF 测定基于 LD 特异性荧光染料 LD540，它允许通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞测定对 LD 进行定量。LDF测定可用于表征人类肠道上皮细胞的LD形成，或研究影响LD代谢的人类（遗传）疾病，如DGAT1缺乏症。此外，这种测定也可用于高通量管道，以测试新的治疗化合物，恢复肠道或其他类型的有机体LD形成的缺陷。

为了正确分析LD形成，在用OA刺激和随后的染色之前，器官不应播种太密集。这对共聚焦和板读取器读出尤其重要，因为重叠的有机体可能会干扰荧光。显示了适当的有机物播种密度（图1A）和具有重叠有机物的培养物（图1B）。为了尽量减少OA样品刺激的变异性，在一个实验中，有机体大小和播种密度?...

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A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

该协议描述了在脂肪酸刺激下人体肠道器官中脂液滴（LD）形成的表征测定。我们讨论了这种测定如何用于LD形成定量，以及如何用于影响LD形成的药物的高通量筛选。

人类肠道器官脂滴形成特征化和定量的荧光测定

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

本协议介绍了一些量化人类肠道器官中脂滴形成的方法。它可以用作高通量筛选平台，以测试调节脂滴形成的药物。我们描述的方法是基于脂滴特异性染料和活检衍生的肠道器官。因此，它为脂滴的形成提供了一个稳定、准确和生理相关的模型。该协议可用于筛选患者特有的新药候选者，这些候选药物可调节脂滴的形成，例如，在DGAT1缺陷患者中。这种脂滴形成测定也可以应用于其他类型的器官培养物，以研究其他细胞类型的脂质代谢。测定在很大程度上取决于器官培养的密度。努力确保样品和实验的有机体密度一致。这种测定的视觉演示至关重要，因为展示应如何培养器官以及如何处理器官以确保对脂滴形成进行正确分析非常重要。制备器官后，小心吸气培养基，而不干扰地下室膜基质的液滴。在有机体的第一井中加入500微升的冷基底介质。使用 P1000 移液器，上下轻轻移液器，用有机体破坏地下室膜基质液滴。在下一个和要求中使用相同的介质重复此程序，但每 500 微升基基介质中收获不超过两口井。在低结合的1.5毫升微离心管中收集器官，并在迷你台式离心机中旋转15至20秒。在旋转的器官中加入400微升的尝试素。在37摄氏度的水浴中孵育5分钟。接下来，使用P200移液器轻轻移液，上下移液，以扰乱细胞的剩余聚集体。在37摄氏度的水浴中孵育5分钟。当仅保留单个细胞时，添加一毫升基底介质，并在微型桌面离心机中旋转细胞 15 到 20 秒。完全吸上一道。使用 P200 移液器在 200 微升新鲜 hSI-EM 中重新悬浮单个细胞，并添加另外 800 微升的 hSI-EM。然后计算悬浮细胞的数量，并计算最终细胞密度所需的细胞体积。拿出适当的悬浮量，将密度调整到每微升750个细胞。以二比一的比例将基底膜基质添加到细胞悬浮液中。轻轻移液吊架混合，小心避免产生气泡。在预热培养板中，如果该钢板有 24 孔或每孔有 96 孔，则每孔播种三个 10 微升液滴。将板放在37摄氏度的培养箱中，用5%的二氧化碳放置10至15分钟，以凝固液滴。同时，在37摄氏度的水浴中预热适当体积的hSI-EM+Y。在此之后，请小心地将预热的 hSI-EM+Y 添加到板的每个井中。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。两到三天后，用 hSI-EM 替换介质，并确保每周刷新两到三次。首先，在室温下重0.2克液态油酸。加入1.5毫升培养级无菌PBS，将混合物加热至70摄氏度一小时，确保间歇性涡旋。接下来，重5.89克无脂肪酸BSA，溶解在33.9毫升PBS中。在37摄氏度的水浴中加热混合物，直到BSA完全溶解。再次对油酸混合物进行涡流，形成细滴乳液，并立即使用玻璃移液器将其添加到 BSA 溶液中。将混合物保持在37摄氏度，30分钟，直到一个清晰的黄色溶液仍然存在。通过前面描述的器官，将器官衍生的单细胞播种成黑色清底96井板。在hSI-EM的栽培第六天，用含有一毫摩尔的油酸和BSA结合的hSI-EM取代培养基。在0.1微摩尔DGAT1抑制剂存在或不存在的情况下，在37摄氏度下孵育细胞16至17小时。在此之后，吸气介质而不干扰地下室膜基质液滴。在室温下，在井中加入100微升4%中性缓冲甲醛，将30分钟固定在井中， 固定器官。轻轻去除甲醛，用每井150微升PBS小心清洗细胞。将脂质液滴的细胞在PBS中用每毫升025毫克LD540和DAPI染色15分钟，在黑暗中室温下。然后用 PBS 小心地清洗水井。对于整个器官的概述图像，使用 40 倍主观适合共生荧光成像。使用此处显示的激发和发射设置将显微镜设置为 DAPI 和 LD540 染料的图像。将针孔大小设置为一个通风单元，以获得足够的 z 轴分辨率。要成像球形器官的一半，将 z 堆栈设置为大约 85 微米。使用适当的图像处理系统，通过单击"图像、堆栈、Z 项目"，将每个器官的 z 堆栈转换为最大投影。通过单击"图像、调整"、阈值，将最大投影的阈值设置为 BSA 车辆控制样本中看不到 LD540 信号的水平。使用这些设置对每个图像进行阈值。然后使用"分析、分析粒子"功能测量每个最大投影的荧光总面积。为了正确分析脂滴的形成，在用油酸和随后的染色刺激之前，不应将有机体播种得太密集。这对于共和器和板读器读出尤其重要，因为重叠的器官可能会干扰荧光。在用一毫摩尔酸过夜刺激后，可以使用倒置的亮场显微镜进行脂质液滴的形成。脂滴的积累散射透射光，因此器官看起来更暗，而非刺激的器官具有半透明的外观。一旦油酸刺激的有机体被固定和染色，脂液滴的形成可以使用共和显微镜可视化。由于器官是3D结构，由于对焦背景信号外，常规荧光显微镜不适合使用，因此使用共聚焦z堆栈来描述器官中的LDF。还可以使用荧光板读卡器对荧光霍赫斯特信号进行共和显微镜样品的定量。板读卡器测定表明，与未经治疗的器官类相比，使用DGAT1抑制剂治疗的器官细胞中的LD540信号显著减少。利用流动细胞计可以实现单个细胞LD形成量。此处所示的浇注策略是分离的人类肠道器官。SSC-A 和最终活细胞群体LD540信号的代表性直方图表明，由于细胞内脂液滴的形成，脂滴的形成将导致SSC-A的增加。此外，LD540污渍储存在脂质液滴中，信号也会在脂滴形成诱导时增加。因此，脂滴的形成被测量为 SSC-A 和 LD540 平均荧光强度的变化。该协议最关键的步骤是人体肠道有机体培养和油酸对BSA的适当波纹。为了适应更多的条件，可以使用荧光板读卡器分析此测定方法。为了纠正每井的风化数，LD540信号被规范化为DAPI信号。通过这项技术，研究人员可以研究器官系统中的脂液滴的形成，并改进电子显微镜等各种分析技术，以验证他们的发现。

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Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

毛喉素诱导在肠组织体溶胀：一个<em&gt;体外</em&gt;检测方法的评估囊性纤维化患者对药物的反应

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

荧光介导的断层扫描对巨噬细胞相关小鼠肠道炎症的检测和定量

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

一种基于动力学荧光的 Ca2 +动员法, 用于识别 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗器和构调制器

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

大鼠同时心电图记录及侵入性血压测量

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

研究活体器官的肠道屏障分解

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...