Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Vi takker B. Spee for generøst at give LD540. Dette arbejde blev støttet af en nederlandsk organisation for videnskabeligt forskningstilskud (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) til S.M.

Alle forsøg med humane væv beskrevet heri blev godkendt af det etiske udvalg på University Medical Center Utrecht (UMCU). Informeret samtykke til vævs indsamling, produktion, oplagring og brug af organoider blev indhentet fra patienter på Wilhelmina children's Hospital (WKZ)-UMCU.
1. forberedelse af kultur medier
Bemærk: Denne protokol skal udføres i et biosikkerheds kabinet. Organoider bør håndteres i henhold til standard cellekultur retning...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Her giver vi en protokol til bestemmelse af LD dannelse i humane intestinale organoider ved inkubation med oliesyre. Denne metode er baseret på LD-specifikke fluorescerende farvestof LD54018, som giver mulighed for karakterisering og kvantificering af den samlede mængde af lipid dråber i en organoid kultur. Procedurerne for at etablere og vedligeholde humane tarm organoide kulturer er blevet offentliggjort før13, og en visuel vejledning af denne protokol er tilgængelig...

Lipider er en afgørende bestanddel af den menneskelige kost og spiller en vigtig rolle i systemisk energilagring og metabolisme. Når indtages, kosten lipider nedbrydes til frie fedtsyrer (FFAs) og monoglycerider (MGs) af bugspytkirtlen lipases. Disse substrater tages derefter op af enterocytterne i tarm Epitelet, hvor de først re-esterificeret til diglycerider (DG) ved i acyltransferaser (mgat) enzymer og efterfølgende til triglycerider (TG) af vegetabilsk diacylglycerololie acyltransferase 1 (DGAT1)1. Endelig, disse TGS er integreret i enten chylomikroner til eksport til lymfesystemet eller cytosolisk lipid dråber (LDs) for intracellulære opbevaring2,3. Selvom chylomikroner er nødvendige for at distribuere lipider med kosten til andre organer, er betydningen af intracellulær fedt oplagring i LDs ikke helt klar. Men LDs har vist sig at udføre en regulerende funktion i tarmen, da de langsomt frigiver lipider i cirkulation op til 16 timer efter et måltid4. Desuden har LDs vist sig at beskytte mod giftige fedtsyrer koncentrationer, såsom i mus adipocytter under lipolytiske betingelser5.
DGAT1-proteinet er placeret på endoplasmatiske reticulum (er) membranen og spiller en afgørende rolle i ld dannelse i tarm epitelet. Homozygot mutationer i DGAT1 føre til tidlig debut svær diarré og/eller opkastning, hypoalbuminæmi, og/eller (fatal) protein-tabende enteropati med tarm svigt på fedt indtag, illustrerer betydningen af DGAT1 i lipid homøostase af den menneskelige tarm epitelet6,7,8,9,10. Da forekomsten af DGAT1-mangel hos mennesker er sjælden, har adgang til primære patient-afledte celler været knappe. Endvidere, den langsigtede kultur af tarm epiteliale celler har længe været begrænset til tumor-afledte cellelinjer, som repræsenterer den normale fysiologi kun til en begrænset udvidelse. Derfor er DGAT1-medieret ld formation for det meste blevet undersøgt i fibroblaster eller dyr-afledte cellelinjer7,10,11,12. Som sådan, det blev for nylig påvist, at DGAT1-mangelfuld patient-afledte fibroblaster akkumulere mindre LDs sammenlignet med raske kontrol celler efter stimulation med oliesyre (OA)8.
Tidligere blev der etableret protokoller til kultur epiteliale stamceller fra alle gastrointestinale organer i form af tredimensionale (3D) organoider13. Disse intestinale organoider kan holdes i kultur i en lang periode af tid13, og tillade funktionelle undersøgelse af patient-og tarm placering-specifikke epiteliale karakteristika14. De er genetisk og fænotypisk stabile og kan lagres, tillader langsigtet ekspansion og biobanking13.
Vi har for nylig påvist, at LD dannelse let kan måles i humane intestinale organoider i en LD formation (LDF) assay6. Når de udsættes for OA for 16 timer, genererer organoider LDs for at beskytte cellerne mod lipid-induceret toksicitet. Når OA koncentrationer er for høje, cellerne dør af caspase-medieret apoptose6. LDF-analysen blev tidligere påvist at være stort set afhængig af DGAT1 som angivet af organoider afledt af DGAT1-mutant patienter og ved anvendelse af DGAT1-specifikke hæmmere6.
For ldf-analysen, der er beskrevet i detaljer her, dyrkes 3D-organoider fra intestinale biopsier og er urerne ugentligt ved afbrydelse i enkeltceller, der nemt danner nye organoider. For at køre LDF-analysen er ~ 7.500 organoid-afledte enkeltceller belagt i hver brønd af en 24-brønd plade. Organoider dannes over flere dage, inkuberet natten over med 1 mM OA og farves med LD540, en fluorescerende celle-permeable LD-specifikke farvestof, der letter billeddannelse. LD-dannelsen kvantificeres derefter ved Konfokal mikroskopi, fluorescerende plade læser eller strømnings cytometri.
Ved at skalere denne LD formation assay til en 96-brønd format, kan analysen også anvendes til high-gennemløb analyse af LD dannelse til skærmen for nye lægemidler, som påvirker LD dannelse i humane tarm organoid kulturer, eller at studere (menneskelige genetiske) lidelser, der påvirker LD metabolisme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Kosten lipider er taget op som frie fedtsyrer (FAs) af tarm epitelet. Disse FAs er intracellulært omdannet til triglycerid (TG) molekyler, før de er pakket ind i chylomikroner til transport til lymfeknuder eller i cytosolisk lipid dråber (LDs) til intracellulære opbevaring. Et afgørende skridt for dannelsen af LDs er den katalytiske aktivitet af vegetabilsk diacylglycerololie acyltransferaser (DGAT) i det sidste trin af TG-syntesen. LDs er vigtigt at buffer giftige lipidarter og regulere cellulære metabolisme i forskellige celletyper. Da det humane tarm epitelet jævnligt konfronteres med høje koncentrationer af lipider, er LD formation af stor betydning for at regulere homøostase. Her beskriver vi en simpel assay til karakterisering og kvantificering af LD formation (LDF) ved stimulation med den mest almindelige umættede fedtsyrer, oliesyre, i humane intestinale organoider. LDF-analysen er baseret på det LD-specifikke fluorescerende farvestof LD540, som giver mulighed for kvantificering af LDs ved Konfokal mikroskopi, fluorescerende plade læser eller flowcytometri. LDF-analysen kan anvendes til at karakterisere LD dannelse i humane tarm epiteliale celler eller til at studere humane (genetiske) lidelser, der påvirker LD metabolisme, såsom DGAT1 mangel. Desuden kan denne analyse også anvendes i en høj-gennemløb rørledning til at teste nye terapeutiske forbindelser, som genoprette defekter i LD dannelse i tarm eller andre typer af organoider.

For korrekt analyse af LD dannelse, organoider bør ikke seedet for tæt før stimulation med OA og efterfølgende farvning. Dette er især af betydning for Konfokal og plade læser udlæsning, da overlappende organoider kan forstyrre fluorescens. Et eksempel på korrekt organoid såning tæthed (figur 1A) og en kultur med overlappende organoider er vist (figur 1B). For at minimere variabiliteten...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Denne protokol beskriver en analyse til karakterisering af lipid dråbe (LD) dannelse i humane intestinale organoider ved stimulation med fedtsyrer. Vi diskuterer, hvordan denne analyse bruges til kvantificering af LD dannelse, og hvordan det kan bruges til høj gennemløbs screening for lægemidler, der påvirker LD dannelse.

En fluorescens-baseret assay til karakterisering og kvantificering af lipid-Dråbedannelse i humane tarm Organoider

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Denne protokol beskriver nogle metoder til kvantificering af lipiddråbedannelse i humane tarmorganoider. Det kan bruges som en høj-throughput screening platform til at teste for lægemidler, der modulerer lipid dråbe dannelse. Den metode, vi beskriver, er baseret på en lipid dråbe-specifikke farvestof og biopsi-afledte intestinal organoids.Det giver dermed en stabil, præcis og fysiologisk relevant model for lipiddråbedannelse. Denne protokol kan bruges til at screene for patientspecifikke nye lægemiddelkandidater, der modulerer lipiddråber dannelse, for eksempel i DGAT1-mangelfuld patienter. Denne lipid dråbe dannelse assay kan også anvendes til andre typer af organoid kulturer til at studere lipid metabolisme i andre celletyper.Analysen er i høj grad afhængig af organoidkulturens masse. Prøv at sikre en ensartet organoid tæthed på tværs af prøver og eksperimenter. Visuel demonstration af denne analyse er kritisk, fordi det er vigtigt at vise, hvordan organoid skal dyrkes, og hvordan de skal håndteres for at sikre en korrekt analyse af lipid dråbedannelse.Efter forberedelse af organoids, omhyggeligt aspirere kulturmediet uden at forstyrre dråber af kælderen membran matrix. Tilføj 500 mikroliter af koldt basalt medium til den første brønd af organoider. Ved hjælp af en P1000 pipette, forsigtigt pipette op og ned for at forstyrre kælderen membran matrix dråber med organoids.Gentag disse procedurer med det samme medium i det næste såvel som nødvendigt, men ikke høste mere end to brønde pr 500 mikroliter af basal medium. Opsaml organoiderne i et lavtbindende 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og drej dem ned i en mini-bordplade centrifuge i 15 til 20 sekunder. Tilføj 400 mikroliter trypsin til spundet-down organoids.Inkuberes i et vandbad ved 37 grader Celsius i fem minutter. Brug derefter en P200-pipette til forsigtigt at pipette suspensionen op og ned for at forstyrre de resterende aggregater af celler. Inkuberes i et vandbad ved 37 grader Celsius i fem minutter.Når der kun er enkelte celler tilbage, tilsættes en milliliter basalt medium, og drej ned cellerne i en mini-bordplade centrifuge i 15 til 20 sekunder. Inspirer supernatanten helt. Brug en P200-pipette til at re-suspendere de enkelte celler i 200 mikroliter af frisk hSI-EM, og tilsæt yderligere 800 mikroliter hSI-EM.Derefter tælle antallet af celler i suspension og beregne mængden af celler, der er nødvendige for den endelige celletæthed. Tag den passende affjedringsvolumen ud og juster tætheden til 750 celler pr. mikroliter. Tilføj kældermembran matrix til celle suspension i et forhold på to-til-en.Pipetter forsigtigt suspensionen for at blande, og pas på at undgå at skabe bobler. I en forvarplet kulturplade, frø ud tre 10-microliter dråber per brønd, hvis pladen har 24 brønde eller en fem-mikroliter dråbe pr godt, hvis pladen har 96 brønde. Placer pladen i en inkubator ved 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid i 10 til 15 minutter for at størkne dråberne.I mellemtiden, pre-varm en passende mængde hSI-EM + Y i et vandbad ved 37 grader Celsius. Derefter tilsættes omhyggeligt den forvarmte hSI-EM+Y til hver brønd på pladen. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med fem procent kuldioxid.Efter to til tre dage skal mediet udskiftes med hSI-EM, og du skal sørge for at opdatere det to til tre gange om ugen. Først vejes 0,2 gram flydende oliesyre ved stuetemperatur. Tilføj 1,5 milliliter kultur-grade sterile PBS og varme blandingen til 70 grader Celsius i en time og sørg for at vortex intermitterende.Dernæst vejes 5,89 gram fedtsyre-fri BSA og opløse det i 33,9 milliliter PBS. Varm blandingen i et vandbad ved 37 grader Celsius, indtil BSA er helt opløst. Vortex oliesyre blandingen igen for at skabe en emulsion af fine dråber og straks tilføje det til BSA opløsning ved hjælp af et glas pipette.Hold blandingen på 37 grader Celsius i 30 minutter, indtil en klar gullig opløsning forbliver. Passage organoiderne som tidligere beskrevet og frø ud organoid-afledte enkelte celler i en sort klar bund 96-godt plade. På dag seks af dyrkning på hSI-EM erstattes kulturmediet med hSI-EM indeholdende en millimolar oliesyre og BSA konjugat.Inkuber cellerne i 16 til 17 timer ved 37 grader Celsius i tilstedeværelse eller fravær af 0,1 micromolar DGAT1-hæmmer. Efter dette, aspirere mediet uden at forstyrre kælderen membran matrix dråber. Fiksere organoiderne ved at tilføje 100 mikroliter af fire procent neutral bufferformant til brøndene i 30 minutter ved stuetemperatur.Fjern formaldehyd forsigtigt og omhyggeligt vaske cellerne med 150 mikroliter af PBS per brønd. Pletcellerne for lipiddråber med 025 mg/milliliter LD540 og DAPI i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Derefter vaskes brøndene omhyggeligt med PBS.For oversigt billeder af hele organoider bruge en 40X subjektiv velegnet til konfokale fluorescerende billeddannelse. Indstil mikroskopet til billede for DAPI og LD540 farvestoffet ved hjælp af excitation og emission indstillinger vist her. Indstil pinhole-størrelsen til én luftig enhed for tilstrækkelig z-akseopløsning.Til billede halvdelen af en sfærisk organoid indstille en z-stack til ca 85 mikrometer. Ved hjælp af et passende billedbehandlingssystem skal du omdanne z-stakken for hver organoid til en maksimal projektion ved at klikke på Billede, Stakke, Z Project. Indstil tærsklen for den maksimale projektion til et niveau, hvor der ikke er noget LD540-signal synligt i BSA-køretøjskontrolprøven, ved at klikke på Billede, Juster, Tærskelværdi.Brug disse indstillinger til at gå ned på hvert billede. Derefter måle det samlede område af fluorescens for hver maksimal projektion ved hjælp af funktionen Analyser, Analyser partikler. For korrekt analyse af lipid dråbedannelse bør organoiderne ikke sås for tæt før stimulering med oliesyre og efterfølgende farvning.Dette er især af betydning for konfokale og pladelæser udlæsning, da overlappende organoider kan forstyrre fluorescens. Efter stimulation med en millimolar oliesyre natten over, lipid dråbe dannelse kan visualiseres med en omvendt lyse felt mikroskop. Ophobningen af lipiddråber spreder overført lys, og derfor synes organoiderne mørkere, mens ikke-stimulerede organoider har et gennemsigtigt udseende.Når oliesyre-stimuleret organoids er fastgjort og farves, lipid dråbe dannelse kan visualiseres ved hjælp af en konfokal mikroskop. Da organoiderne er 3D-strukturer, er et almindeligt epifluorescerende mikroskop ikke egnet på grund af baggrundssignalet uden for fokus, så en konfokal z-stak bruges til at karakterisere LDF i organoider. Kvantificering af konfokale mikroskopiprøver kan også udføres ved hjælp af en fluorescerende pladelæser normaliseret til fluorescerende Hoechst signal.Pladelæseranalysen indikerer et signifikant fald i LD540-signalet i organoidceller behandlet med DGAT1-hæmmer sammenlignet med ubehandlede organoider. Kvantificering af LD-formation i individuelle celler kan opnås ved hjælp af et flowcytometer. Den gating strategi vist her er for dissociated menneskelige intestinale organoids.Repræsentative histogrammer for både SSC-A og LD540-signalet fra den endelige levende cellepopulation viser, at lipiddråbedannelse vil resultere i en stigning i SSC-A på grund af dannelsen af intracellulære lipiddråber. Desuden LD540 pletter til lipider, der er gemt i lipid dråber, og signalet vil også stige ved induktion af lipid dråbe dannelse. Som sådan måles lipiddråbeformation som et skift i den gennemsnitlige fluorescerende intensitet af både SSC-A og LD540.De mest afgørende trin i denne protokol er kulturen af menneskelige tarm organoider og den korrekte korrugering af oliesyre til BSA. For at imødekomme flere betingelser, kan denne analyse analyseres ved hjælp af en fluorescerende pladelæser. For at korrigere for organoidtallet pr. brønd blev LD540-signalet normaliseret til DAPI-signalet.Med denne teknik, forskere kan studere lipid dråbe dannelse i organoid systemer, og forbedre forskellige analyseteknikker såsom elektron mikroskopi til at validere deres resultater.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Dannelse Assay fra human brystkræft væv og cellelinier

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Udnyttelse af blød agar Colony Formation Assay til at identificere inhibitorer for tumorgenicitet for Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Etablering og karakterisering af UTI og CAUTI i en musemodel

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering efter en ny Disaggregering Metode til Skin Micro-udtagne transplantater Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk endotelcelle Tube Formation Assay: Sammenligning ekstracellulære matrix og vækstfaktor nedsat ekstracellulær matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-medieret tomografi til påvisning og kvantificering af makrofag-relaterede Murine tarmbetændelse

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

En kinetisk fluorescens-baserede Ca2 + mobilisering Assay at identificere G Protein-koblet Receptor agonister og antagonister allosteriske modulatorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Samtidige Elektrokardiografi optagelse og Invasive blod pres måling i rotter

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Undersøgelse intestinal barriere opdeling i levende organoider

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...