Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Wij danken B. Spee voor het royaal verstrekken van LD540. Dit werk werd gesteund door een Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek subsidie (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) naar S.M.

Alle experimenten met menselijke weefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door het ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU). Geïnformeerde toestemming voor weefsel inzameling,-opwekking,-opslag en-gebruik van de organoïden werd verkregen van patiënten in het Wilhelmina Children's Hospital (WKZ)-UMCU.
1. voorbereiding van cultuur media
Opmerking: Dit protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast....

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Hier bieden we een protocol om LD-vorming in humane intestinale organoïden te bepalen bij incubatie met oliezuur. Deze methode is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD54018, die de karakterisering en kwantificering van het totale volume van lipide druppeltjes binnen een organoïde cultuur mogelijk maakt. De procedures voor het vaststellen en handhaven van humane intestinale organoïde culturen zijn gepubliceerd vóór13, en een visuele gids van dit prot...

Lipiden zijn een cruciaal onderdeel van het menselijk dieet en spelen een belangrijke rol in de systemische energieopslag en metabolisme. Wanneer geconsumeerd, dieet lipiden worden afgebroken in vrije vetzuren (FFAS) en monoglyceriden (MGS) door alvleesklier lipases. Deze substraten worden vervolgens ingenomen door de enterocyten van het intestinale epitheel, waar ze voor het eerst opnieuw veresterd worden naar diglyceriden (DG) door monoglyceriden acyltransferases (MGAT)-enzymen en vervolgens naar triglyceriden (TG) door diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Tot slot, deze TGS zijn geïntegreerd in ofwel chylomicronen voor export naar het lymfestelsel of cytosolische lipide druppeltjes (LDS) voor intracellulaire opslag2,3. Hoewel chylomicronen nodig zijn om voedings lipiden naar andere organen te verdelen, is het belang van intracellulaire vetopslag in LDS niet helemaal duidelijk. Echter, LDs is aangetoond dat het uitvoeren van een regelgevende functie in de darm, als ze langzaam vrijkomen lipiden in de circulatie tot 16 h na een maaltijd4. Bovendien heeft LDs aangetoond dat het beschermt tegen toxische vetzuur concentraties, zoals bij muizen met de lipolytische condities5.
Het DGAT1 eiwit bevindt zich op het endoplasmisch reticulum (ER) membraan en speelt een cruciale rol in de LD-formatie in het intestinale epitheel. Homozygoot mutaties in DGAT1 leiden tot vroegtijdige ernstige diarree en/of braken, hypoalbuminemie en/of (fatale) proteïne-verliezen enteropathie met intestinale insufficiëntie bij vetopslag, ter illustratie van het belang van DGAT1 in lipide homeostase van de menselijke intestinale epitheel6,7,8,9,10. Sinds het optreden van DGAT1-deficiëntie bij de mens is zeldzaam, toegang tot primaire patiënt-afgeleide cellen is schaars. Bovendien, de lange-termijn cultuur van intestinale epitheliale cellen is al lange tijd beperkt tot tumor-afgeleide cellijnen die de normale fysiologie alleen voor een beperkte uitbreiding vertegenwoordigen. Daarom is DGAT1-gemedieerde LD-formatie meestal bestudeerd in fibroblasten of dierlijke cellijnen7,10,11,12. Als zodanig werd onlangs aangetoond dat DGAT1-deficiënte door patiënten afgeleide fibroblasten minder LDs accumuleren in vergelijking met gezonde controle cellen na stimulatie met oliezuur (OA)8.
Voorheen werden protocollen vastgesteld voor de kweek van epitheliale stamcellen uit elk gastro-intestinaal orgaan in de vorm van driedimensionale (3D) organoïden13. Deze intestinale organoïden kunnen worden bewaard in cultuur voor een lange periode van tijd13, en laat de functionele studie van patiënt-en intestinale locatie-specifieke epitheliale kenmerken14. Ze zijn genetisch en fenotypisch stabiel en kunnen worden opgeslagen, waardoor lange termijn expansie en biobankingen13.
We hebben onlangs aangetoond dat LD-vorming gemakkelijk kan worden gemeten in humane intestinale organoïden in een LD-formatie (LDF)-assay6. Bij blootstelling aan OA voor 16 uur genereren organoïden LDs om de cellen te beschermen tegen lipide-geïnduceerde toxiciteit. Wanneer OA concentraties te hoog zijn, sterven de cellen door caspase-gemedieerde apoptosis6. De LDF-test werd eerder aangetoond grotendeels afhankelijk te zijn van DGAT1, zoals aangegeven door organoïden afgeleid van DGAT1-Mutant patiënten en door het gebruik van DGAT1-specifieke remmers6.
Voor de in detail beschreven LDF-assay worden 3D-organoïden gekweekt uit intestinale biopsieën en worden wekelijks door een verstoring in afzonderlijke cellen geprikt die gemakkelijk nieuwe organoïden vormen. Voor het uitvoeren van de LDF-assay worden ~ 7.500 organoid-afgeleide enkelvoudige cellen in elk goed van een 24-put plaat verguld. Organoïden worden gevormd gedurende meerdere dagen, gebroed met een nacht met 1 mM OA en gekleurd met LD540, een fluorescerende cel-permeabele LD-specifieke kleurstof die Imaging vergemakkelijkt. De LD-formatie wordt vervolgens gekwantificeerd door confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie.
Door deze LD-formatie test te schalen naar een 96-well-indeling, kan de assay ook worden gebruikt voor analyses met een hoge doorvoer van LD-vorming naar het scherm voor nieuwe geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden in humane intestinale organoïde culturen, of om (menselijke genetische) aandoeningen te bestuderen die invloed hebben op LD metabolisme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Dieet lipiden worden ingenomen als vrije vetzuren (FAs) door het intestinale epitheel. Deze FAS zijn intracellulair omgezet in triglyceriden (TG) moleculen, voordat ze worden verpakt in chylomicronen voor transport naar de lymfe of in cytosolische lipide druppels (LDS) voor intracellulaire opslag. Een cruciale stap voor de vorming van LDs is de katalytische werking van diacylglycerolacyltransferases (DGAT) in de laatste stap van TG-synthese. LDs zijn belangrijk voor de buffer van toxische lipiden soorten en reguleren van cellulaire metabolisme in verschillende celtypen. Omdat het menselijke darm epitheel regelmatig wordt geconfronteerd met hoge concentraties van lipiden, is LD-vorming van groot belang om homeostase te reguleren. Hier beschrijven we een eenvoudige assay voor de karakterisering en kwantificering van LD-vorming (LDF) bij stimulatie met het meest voorkomende onverzadigde vetzuren, oliezuur, in humane intestinale organoïden. De LDF-test is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD540, die het mogelijk maakt om LDs te kwantificeren met confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie. De LDF-test kan worden gebruikt om LD-vorming in menselijke intestinale epitheelcellen te karakteriseren, of om menselijke (genetische) aandoeningen te bestuderen die het LD-metabolisme beïnvloeden, zoals DGAT1-deficiëntie. Bovendien kan deze test ook worden gebruikt in een pijpleiding met hoge doorvoer om nieuwe therapeutische verbindingen te testen, die defecten in LD-vorming in intestinale of andere soorten organoïden herstellen.

Voor een juiste analyse van LD-vorming mogen de organoïden niet te dicht bij de stimulatie met OA en daaropvolgende vlekken worden geseeld. Dit is vooral van belang voor de confocale en plaat lezer uitlezen, omdat overlappende organoïden de fluorescentie kunnen verstoren. Er wordt een voorbeeld gegeven van de juiste organoïde-zaaien dichtheid (Figuur 1A) en een cultuur met overlappende organogeniden (Figuur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Dit protocol beschrijft een assay voor de karakterisering van lipide druppel (LD) vorming in humane intestinale organoïden bij stimulatie met vetzuren. We bespreken hoe deze assay wordt gebruikt voor de kwantificering van LD-vorming, en hoe het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden.

Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Dit protocol beschrijft een aantal methoden om lipide druppelvorming in menselijke darmorganoïden te kwantificeren. Het kan worden gebruikt als een high-throughput screening platform om te testen op geneesmiddelen die lipide druppelvorming moduleren. De methode die we beschrijven is gebaseerd op een lipide druppelspecifieke kleurstof en biopsie-afgeleide darmorganoïden.Het biedt daardoor een stabiel, nauwkeurig en fysiologisch relevant model voor lipidedruppelvorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te screenen op patiëntspecifieke kandidaat-geneesmiddelenkandidaten die de vorming van lipidedruppels moduleren, bijvoorbeeld bij DGAT1-patiënten. Deze lipide druppelvorming test kan ook worden toegepast op andere soorten organoïde culturen om lipide metabolisme studie in andere celtypes.De test is in belangrijke mate afhankelijk van de dichtheid van de organoïde cultuur. Probeer een consistente organoïde dichtheid te garanderen tussen monsters en experimenten. Visuele demonstratie van deze test is van cruciaal belang omdat het belangrijk is om te laten zien hoe de organoïde moet worden gekweekt en hoe ze moeten worden behandeld om een goede analyse van lipide druppelvorming te garanderen.Na het voorbereiden van de organoïden, zorgvuldig aspirate de cultuur medium zonder verstoring van de druppels van kelder membraan matrix. Voeg 500 microliters koud basaal medium toe aan de eerste put van organoïden. Met behulp van een P1000 pipet, voorzichtig pipette op en neer om de kelder membraan matrix druppels verstoren met organoïden.Herhaal deze procedures met hetzelfde medium in de volgende goed als vereist, maar oogst niet meer dan twee putten per 500 microliter van basaal medium. Verzamel de organoïden in een laag-bindende 1,5 milliliter microcentrifuge buis, en draai ze naar beneden in een mini-tafelblad centrifuge gedurende 15 tot 20 seconden. Voeg 400 microliter trypsine toe aan de gesponnen organoïden.Incubeer in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een P200 pipet om de suspensie voorzichtig op en neer te pipetten om de resterende aggregaten van cellen te verstoren. Incubeer in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Wanneer slechts enkele cellen overblijven, voeg een milliliter basaal medium, en spin de cellen in een mini-tafelblad centrifuge voor 15 tot 20 seconden. Aspirate de supernatant volledig. Gebruik een P200 pipet om de enkele cellen opnieuw op te schorten in 200 microliter verse hSI-EM en voeg nog eens 800 microliter hSI-EM toe.Tel vervolgens het aantal cellen in suspensie en bereken het volume van de cellen die nodig zijn voor de uiteindelijke celdichtheid. Neem het juiste suspensievolume en pas de dichtheid aan op 750 cellen per microliter. Voeg keldermembraanmatrix toe aan de celopening in een verhouding van twee tegen één.Voorzichtig pipette de schorsing te mengen voorzichtig om te voorkomen dat het creëren van bubbels. In een voorverwarmde kweekplaat, zaad uit drie 10-microliter druppeltjes per goed als de plaat heeft 24 putten of een vijf-microliter druppel per goed als de plaat heeft 96 putten. Plaats de plaat in een couveuse op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide gedurende 10 tot 15 minuten om de druppels te stollen.Ondertussen, pre-warm een passend volume van hSI-EM +Y in een waterbad op 37 graden Celsius. Voeg hierna voorzichtig de voorverwarmde hSI-EM+Y toe aan elke put van de plaat. Broed de cellen uit op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide.Vervang het medium na twee tot drie dagen door hSI-EM en zorg ervoor dat u het twee tot drie keer per week verfrist. Weeg eerst 0,2 gram vloeibaar oliezuur bij kamertemperatuur. Voeg 1,5 milliliter steriele PBS van kweekkwaliteit toe en verwarm het mengsel gedurende een uur tot 70 graden Celsius om ervoor te zorgen dat de vortex met tussenpozen wordt.Weeg vervolgens 5,89 gram vetzuurvrije BSA en los het op in 33,9 milliliter PBS. Verwarm het mengsel in een waterbad op 37 graden Celsius tot de BSA volledig is opgelost. Vortex het oliezuurmengsel opnieuw om een emulsie van fijne druppels te creëren en onmiddellijk toe te voegen aan de BSA-oplossing met behulp van een glazen pipet.Houd het mengsel op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten tot een duidelijke geelachtige oplossing blijft. Passage de organoïden zoals eerder beschreven en zaad uit de organoïde-afgeleide enkele cellen in een zwarte clear-bottom 96-put plaat. Vervang op dag zes van het kweken op hSI-EM het kweekmedium door hSI-EM met één millimolar oliezuur en BSA-conjugaat.Incubeer de cellen gedurende 16 tot 17 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid of afwezigheid van 0,1 micromolar DGAT1-remmer. Daarna, aspirate het medium zonder verstoring van de kelder membraan matrix druppels. Fixeer de organoïden door 100 microliter van vier procent neutraal gebufferd formaldehyde gedurende 30 minuten op kamertemperatuur aan de putten toe te voegen.Verwijder de formaldehyde voorzichtig en zorgvuldig wassen van de cellen met 150 microliter PBS per put. Vlek de cellen voor lipidedruppels met 025 milligram per milliliter LD540 en DAPI in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was vervolgens de putten voorzichtig met PBS.Voor overzichtsbeelden van hele organoïden wordt gebruik gemaakt van een 40X subjectief geschikt voor confocale fluorescerende beeldvorming. Stel de microscoop in op beeld voor DAPI en de LD540 kleurstof met behulp van de hier getoonde excitatie- en emissie-instellingen. Stel de pinhole grootte in op één luchtige eenheid voor voldoende z-as resolutie.Om de helft van een bolvormige organoïde een z-stack op ongeveer 85 micrometer te laten zien. Met behulp van een geschikt beeldverwerkingssysteem transformeert u de z-stack van elke organoïde naar een maximale projectie door op Afbeelding, Stapels, Z Project te klikken. Stel de drempel van de maximale projectie in op een niveau waarin er geen LD540-signaal zichtbaar is in het BSA-voertuigbesturingsmonster door te klikken op Afbeelding, Aanpassen, Drempelwaarde.Gebruik deze instellingen om elke afbeelding te thresholderen. Meet vervolgens het totale gebied van fluorescentie voor elke maximale projectie met behulp van de functie Analyseren, Deeltjes analyseren. Voor een goede analyse van lipidedruppelvorming mogen de organoïden niet te dicht worden gezaaid voorafgaand aan stimulatie met oliezuur en daaropvolgende kleuring.Dit is vooral van belang voor de confocale en plaatlezer uitlezing, omdat overlappende organoïden kunnen interfereren met de fluorescentie. Na stimulatie met een millimolar van olie 's nachts, lipide druppelvorming kan worden gevisualiseerd met een omgekeerde helder-veld microscoop. De accumulatie van lipidedruppels verspreidt overgebracht licht, en daarom lijken de organoïden donkerder, terwijl niet-gestimuleerde organoïden een doorschijnend uiterlijk hebben.Zodra de oliezuur-gestimuleerde organoïden zijn vastgesteld en gekleurd, kan de lipide druppelvorming worden gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop. Omdat de organoïden 3D-structuren zijn, is een regelmatige epifluorescente microscoop niet geschikt vanwege het out-of-focus achtergrondsignaal, dus een confocale z-stack wordt gebruikt om LDF in organoïden te karakteriseren. Kwantificering van de confocale microscopie monsters kan ook worden uitgevoerd met behulp van een fluorescerende plaatlezer genormaliseerd op de fluorescerende Hoechst signaal.De plaatlezertest geeft een significante afname aan van het LD540-signaal in organoïde cellen die met DGAT1-remmer worden behandeld in vergelijking met onbehandelde organoïden. Kwantificering van LD-vorming in individuele cellen kan worden bereikt met behulp van een stroomcytometer. De hier getoonde gatingstrategie is voor gescheiden menselijke darmorganoïden.Representatieve histogrammen voor zowel de SSC-A als het LD540-signaal van de laatste live celpopulatie tonen aan dat lipidedruppelvorming zal resulteren in een toename van SSC-A als gevolg van de vorming van intracellulaire lipidedruppels. Bovendien, LD540 vlekken voor lipiden die worden opgeslagen in de lipide druppeltjes, en het signaal zal ook toenemen bij de inductie van lipide druppelvorming. Als zodanig wordt lipidedruppelvorming gemeten als een verschuiving in de gemiddelde fluorescerende intensiteit van zowel SSC-A als LD540.De meest cruciale stappen van dit protocol zijn de cultuur van menselijke darmorganoïden en de juiste golf van oliezuur aan BSA. Om meer voorwaarden tegemoet te komen, kan deze test worden geanalyseerd met behulp van een fluorescerende plaatlezer. Om het organoïde getal per put te corrigeren, werd het LD540-signaal genormaliseerd naar het DAPI-signaal.Met deze techniek kunnen onderzoekers lipidedruppelvorming in organoïde systemen bestuderen en verschillende analysetechnieken verbeteren, zoals elektronenmicroscopie om hun bevindingen te valideren.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Weefsel karakterisering na een New Uitsplitsing Methode voor de huid Micro-Enten Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay voor het beoordelen van de Drug Response in patiënten met cystische fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Gelijktijdige electrocardiografie opname en invasieve bloed druk meting bij ratten

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Onderzoek naar darmbarrière afbraak in levende organoïden

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...