Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Nous remercions B. Spee d'avoir généreusement fourni LD540. Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) à S.M.

Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits ci-dessous ont été approuvées par le comité d'éthique du Centre Médical Universitaire d'Utrecht (UMCU). Le consentement éclairé pour la collecte, la génération, le stockage, et l'utilisation des organoïdes a été obtenu des patients à l'hôpital pour enfants de Wilhelmina (WKZ)-UMCU.
1. Préparation des médias culturels
REMARQUE: Ce protocole doit être exécuté à l'int...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Ici, nous fournissons un protocole pour déterminer la formation de LD dans les organoïdes intestinaux humains lors de l'incubation avec l'acide oleique. Cette méthode est basée sur le colorant fluorescent LD54018, qui permet de caractériser et de quantifier le volume total de gouttelettes lipidiques dans une culture organoïde. Les procédures d'établissement et de maintien des cultures d'organoïdes intestinaux humains ont été publiées avant13, et un guide visuel ...

Les lipides sont un élément crucial de l'alimentation humaine et jouent un rôle important dans le stockage et le métabolisme de l'énergie systémique. Lorsqu'ils sont ingérés, les lipides alimentaires sont dégradés en acides gras libres (AFF) et en monoglycérides (GM) par des lipases pancréatiques. Ces substrats sont ensuite repris par les entéroocytes de l'épithélium intestinal, où ils sont d'abord réestérifiés aux diglycérorides (DG) par des enzymes d'acyltransferases monoglycérides (MGAT) et par la suite aux triglycérides (TG) par le diacylglycérol par le diacylglycérol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Enfin, ces TG sont intégrés soit dans les chylomicrons pour l'exportation vers le système lymphatique ou les gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire2,3. Bien que les chylomicrons soient nécessaires pour distribuer les lipides diététiques à d'autres organes, l'importance du stockage intracellulaire de graisse dans des LDs n'est pas complètement claire. Cependant, LDs ont été montrés pour effectuer une fonction de régulation dans l'intestin, car ils libèrent lentement des lipides dans la circulation jusqu'à 16 h après un repas4. En outre, lDs ont été montrés pour se protéger contre les concentrations toxiques d'acide gras, telles que dans les adipocytes de souris pendant des conditions lipolytiques5.
La protéine DGAT1 est située sur la membrane du réticulum endoplasmique (ER) et joue un rôle crucial dans la formation de LD dans l'épithélium intestinal. Les mutations homozygous dans DGAT1 mènent à la diarrhée grave tôt-début et/ou au vomissement, à l'hypoalbuminemia, et/ou (fatal) entéropathie protéine-perdante avec l'échec intestinal sur la prise de graisse, illustrant l'importance de DGAT1 dans l'homéostasie de lipide de l'humain épithélium intestinal6,7,8,9,10. Puisque l'occurrence de DGAT1-deficiency chez l'homme est rare, l'accès aux cellules patient-dérivées primaires a été rare. En outre, la culture à long terme des cellules épithéliales intestinales a longtemps été limitée aux lignées cellulaires dérivées de tumeurs qui ne représentent la physiologie normale que dans une extension limitée. Par conséquent, la formation de LD DGAT1-négociée a été principalement étudiée dans les fibroblastes ou les lignées cellulaires d'origine animale7,10,11,12. En tant que tel, il a été récemment démontré que les fibroblastes d'origine patiente DGAT1 accumulent moins de LD que les cellules témoins saines après stimulation avec de l'acide oleique (OA)8.
Auparavant, des protocoles ont été établis pour la culture des cellules souches épithéliales de tout organe gastro-intestinal sous la forme d'organoïdes tridimensionnels (3D)13. Ces organoïdes intestinaux peuvent être maintenus en culture pendant une longue période de temps13, et permettent l'étude fonctionnelle des caractéristiques épithéliales spécifiques au patient et à l'intestin14. Ils sont génétiquement et phénotypiquement stables et peuvent être stockés, permettant l'expansion à long terme et la biobanque13.
Nous avons récemment démontré que la formation de LD peut être facilement mesurée dans les organoïdes intestinaux humains dans une formation de LD (LDF) analyse6. Lorsqu'ils sont exposés à l'arthrose pendant 16 h, les organoïdes génèrent des LD pour protéger les cellules contre la toxicité induite par les lipides. Lorsque les concentrations d'arthrose sont trop élevées, les cellules meurent par apoptose à médiation caspase6. L'assay de LDF a été précédemment montré pour être en grande partie dépendant de DGAT1 comme indiqué par des organoïdes dérivés des patients DGAT1-mutants et par l'utilisation des inhibiteurs DGAT1-spécifiques6.
Pour l'analyse LDF décrite en détail ici, les organoïdes 3D sont cultivés à partir de biopsies intestinales et sont passés chaque semaine par perturbation en cellules individuelles qui forment facilement de nouveaux organoïdes. Pour l'exécution de l'assidu, 7 500 cellules uniques d'origine organoïde sont plaquées dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Les organoïdes sont formés sur plusieurs jours, incubés pendant la nuit avec 1 mM d'arthrose et tachés de LD540, un colorant fluorescent perméable lD-spécifique qui facilite l'imagerie. La formation LD est ensuite quantifiée par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux.
En évoluant cette analyse de formation de LD à un format de 96 puits, l'analyse peut également être employée pour l'analyse à haut débit de la formation de LD pour dépister de nouveaux drogues qui affectent la formation de LD dans les cultures d'organoïdes intestinaux humains, ou pour étudier les désordres (génétiques humains) qui affectent Métabolisme LD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Les lipides alimentaires sont pris comme acides gras libres (AF) par l'épithélium intestinal. Ces FUR sont intracellulairement convertis en molécules de triglycérides (TG), avant d'être emballés dans des chylomicrons pour le transport vers la lymphe ou en gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire. Une étape cruciale pour la formation des LDest l'activité catalytique des acyltransferases de diacylglycérol (DGAT) dans l'étape finale de la synthèse de TG. Les LD sont importants pour amortir les espèces lipidiques toxiques et réguler le métabolisme cellulaire dans différents types de cellules. Puisque l'épithélium intestinal humain est régulièrement confronté à des concentrations élevées de lipides, la formation de LD est d'une grande importance pour réguler l'homéostasie. Ici nous décrivons un test simple pour la caractérisation et la quantification de la formation de LD (LDF) sur la stimulation avec l'acide gras insaturé le plus commun, l'acide oliétique, dans les organoïdes intestinaux humains. L'analyse LDF est basée sur le colorant fluorescent LD540 spécifique à LD, qui permet la quantification des LD par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux. L'analyse de LDF peut être employée pour caractériser la formation de LD dans les cellules épithéliales intestinales humaines, ou pour étudier les désordres humains (génétiques) qui affectent le métabolisme de LD, tels que l'insuffisance de DGAT1. En outre, cet essai peut également être employé dans un pipeline à haut débit pour tester de nouveaux composés thérapeutiques, qui restaurent des défauts dans la formation de LD dans l'intestin ou d'autres types d'organoïdes.

Pour l'analyse appropriée de la formation de LD, les organoïdes ne devraient pas être ensemencés trop densément avant la stimulation avec l'arthrose et la coloration suivante. Ceci est particulièrement important pour la lecture confocale et de lecteur de plaque, puisque les organoïdes qui se chevauchent pourraient interférer avec la fluorescence. Un exemple de densité d'ensemencement organoïde appropriée (Figure 1A) et une culture ...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Ce protocole décrit un test pour la caractérisation de la formation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les organoïdes intestinaux humains lors de la stimulation avec des acides gras. Nous discutons de la façon dont cet analyse est utilisé pour la quantification de la formation de LD, et comment il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les médicaments qui affectent la formation de LD.

Un test basé sur la fluorescence pour la caractérisation et la quantification de la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Ce protocole décrit certaines méthodes pour quantifier la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains. Il peut être utilisé comme une plate-forme de dépistage à haut débit pour tester les médicaments qui modulent la formation de gouttelettes lipidiques. La méthode que nous décrivons est basée sur un colorant spécifique aux gouttelettes lipidiques et des organoïdes intestinaux dérivés de biopsie.Il fournit ainsi un modèle stable, précis et physiologiquement pertinent pour la formation de gouttelettes lipidiques. Ce protocole peut être utilisé pour dépister les nouveaux candidats médicaments spécifiques au patient qui modulent la formation de gouttelettes lipidiques, par exemple, chez les patients déficients en DGAT1. Cet essai de formation de gouttelette de lipide peut également être appliqué à d’autres types de cultures organoïdes pour étudier le métabolisme de lipide dans d’autres types de cellules.L’analyse dépend dans une large mesure de la densité de la culture organoïde. Essayez d’assurer une densité organoïde constante entre les échantillons et les expériences. La démonstration visuelle de cet essai est critique parce qu’il est important de montrer comment l’organoïde devrait être cultivé et comment ils devraient être manipulés pour assurer l’analyse appropriée de la formation de gouttelettes lipidiques.Après avoir préparé les organoïdes, aspirez soigneusement le milieu de culture sans déranger les gouttelettes de la matrice membranaire du sous-sol. Ajouter 500 microlitres de milieu basal froid au premier puits d’organoïdes. À l’aide d’une pipette P1000, pipette doucement de haut en bas pour perturber les gouttelettes matricielles membranaires du sous-sol avec des organoïdes.Répétez cette procédure avec le même milieu dans le prochain puits que nécessaire, mais ne récoltez pas plus de deux puits par 500 microlitres de milieu basal. Recueillir les organoïdes dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à faible liaison, et les faire tourner dans une mini-centrifugeuse de table pendant 15 à 20 secondes. Ajouter 400 microlitres de trypsine aux organoïdes filés vers le bas.Incuber dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, utilisez une pipette P200 pour pipette doucement la suspension de haut en bas pour perturber les agrégats restants des cellules. Incuber dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Lorsqu’il ne reste plus qu’une seule cellule, ajouter un millilitre de milieu basal et faire tourner les cellules dans une mini-centrifugeuse de table pendant 15 à 20 secondes. Aspirez complètement le surnatant. Utilisez une pipette P200 pour suspendre à nouveau les cellules individuelles dans 200 microlitres de hSI-EM frais, et ajouter 800 microlitres supplémentaires de hSI-EM.Comptez ensuite le nombre de cellules en suspension et calculez le volume de cellules nécessaires à la densité cellulaire finale. Sortez le volume approprié de suspension et ajustez la densité à 750 cellules par microlitre. Ajouter la matrice membranaire du sous-sol à la suspension cellulaire dans un rapport de deux pour un.Pipette doucement la suspension pour mélanger en prenant soin d’éviter de créer des bulles. Dans une assiette de culture préchauffée, épépinez trois gouttelettes de 10 microlitres par puits si la plaque a 24 puits ou une gouttelette de cinq microlitres par puits si la plaque a 96 puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 10 à 15 minutes pour solidifier les gouttelettes.Pendant ce temps, préchauffer un volume approprié de hSI-EM+Y dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Après cela, ajouter soigneusement le hSI-EM+Y préchauffé à chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.Après deux à trois jours, remplacez le milieu par hSI-EM et assurez-vous de le rafraîchir deux à trois fois par semaine. Tout d’abord, peser 0,2 grammes d’acide oléique liquide à température ambiante. Ajouter 1,5 millilitres de PBS stérile de qualité culturelle et chauffer le mélange à 70 degrés Celsius pendant une heure en s’assurant de vortex par intermittence.Ensuite, pesez 5,89 grammes de BSA sans acides gras et dissolvez-le en 33,9 millilitres de PBS. Réchauffer le mélange dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le BSA soit complètement dissous. Vortex le mélange d’acide oléique à nouveau pour créer une émulsion de gouttelettes fines et immédiatement l’ajouter à la solution BSA à l’aide d’une pipette en verre.Gardez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’une solution jaunâtre claire reste. Passer les organoïdes comme décrit précédemment et semer les cellules individuelles dérivées d’organoïdes dans une plaque noire à fond clair de 96 puits. Le sixième jour de la culture sur hSI-EM, remplacer le milieu de culture par hSI-EM contenant un millimolaire de l’acide oléique et conjugué BSA.Incuber les cellules pendant 16 à 17 heures à 37 degrés Celsius en présence ou en l’absence d’inhibiteur du DGAT1 de 0,1 micromolaire. Après cela, aspirer le milieu sans déranger les gouttelettes de matrice membranaire du sous-sol. Fixez les organoïdes en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde tamponné neutre à quatre pour cent aux puits pendant 30 minutes à température ambiante.Retirer délicatement le formaldéhyde et laver soigneusement les cellules avec 150 microlitres de PBS par puits. Tacher les cellules pour les gouttelettes lipidiques avec 025 milligrammes par millilitre LD540 et DAPI dans PBS pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, lavez soigneusement les puits avec PBS.Pour une vue d’ensemble, les images d’organoïdes entiers utilisent un subjectif 40X adapté à l’imagerie fluorescente confocale. Réglez le microscope à l’image pour DAPI et le colorant LD540 en utilisant les paramètres d’excitation et d’émission montrés ici. Réglez la taille du sténopé sur une unité aérosée pour une résolution z-axe suffisante.Pour l’image de la moitié d’un organoïde sphérique définir une z-pile à environ 85 micromètres. À l’aide d’un système de traitement d’image approprié, transformez la pile z de chaque organoïde en une projection maximale en cliquant sur Image, Stacks, Z Project. Fixez le seuil de la projection maximale à un niveau dans lequel il n’y a pas de signal LD540 visible dans l’échantillon de contrôle du véhicule BSA en cliquant sur Image, Ajuster, Seuil.Utilisez ces paramètres pour seuilr chaque image. Ensuite, mesurez la zone totale de fluorescence pour chaque projection maximale à l’aide de la fonction Analyser, Analyser les particules. Pour une analyse appropriée de la formation de gouttelettes lipidiques, les organoïdes ne doivent pas être ensemencés trop densément avant la stimulation par l’acide oléique et la coloration subséquente.Ceci est particulièrement important pour la lecture confoccale et plaque-lecteur puisque le chevauchement des organoïdes pourrait interférer avec la fluorescence. Après stimulation avec un millimolaire d’acide oléique pendant la nuit, la formation de gouttelettes lipidiques peut être visualisée avec un microscope inversé à champ lumineux. L’accumulation de gouttelettes lipidiques disperse la lumière transmise, et donc les organoïdes semblent plus foncés, tandis que les organoïdes non stimulés ont un aspect translucide.Une fois que les organoïdes stimulés par l’acide oléique sont fixes et tachés, la formation de gouttelettes lipidiques peut être visualisée à l’aide d’un microscope confocal. Comme les organoïdes sont des structures 3D, un microscope épifluorescent régulier n’est pas approprié en raison du signal de fond hors de discussion, de sorte qu’une pile de z confocal est utilisée pour caractériser le LDF chez les organoïdes. La quantification des échantillons de microscopie confoccale peut également être effectuée à l’aide d’un lecteur de plaque fluorescente normalisé au signal fluorescent hoechst.L’analyse de lecteur de plaque indique une diminution significative du signal de LD540 dans les cellules organoïdes traitées avec l’inhibiteur de DGAT1 comparé aux organoïdes non traités. La quantification de la formation de LD dans les cellules individuelles peut être réalisée à l’aide d’un cytomètre d’écoulement. La stratégie de gating montrée ici est pour les organoïdes intestinaux humains dissociés.Les histogrammes représentatifs pour le SSC-A et le signal LD540 de la population finale de cellules vivantes montrent que la formation de gouttelettes lipidiques entraînera une augmentation du SSC-A en raison de la formation de gouttelettes lipidiques intracellulaires. En outre, les taches LD540 pour les lipides qui sont stockés dans les gouttelettes lipidiques, et le signal augmentera également à l’induction de la formation de gouttelettes lipidiques. En tant que tel, la formation de gouttelettes lipidiques est mesurée comme un changement dans l’intensité fluorescente moyenne de SSC-A et LD540.Les étapes les plus cruciales de ce protocole sont la culture des organoïdes intestinaux humains et la corrugation appropriée de l’acide oléique au BSA. Pour répondre à plus de conditions, cet essai peut être analysé à l’aide d’un lecteur de plaque fluorescente. Pour corriger le nombre organoïde par puits, le signal LD540 a été normalisé au signal DAPI.Avec cette technique, les chercheurs peuvent étudier la formation de gouttelettes lipidiques dans les systèmes organoïdes, et améliorer diverses techniques d’analyse telles que la microscopie électronique pour valider leurs résultats.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Recherche

Médecine

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

L&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Création et caractérisation de l&#39;UTI et Cauti dans un modèle de souris

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Caractérisation des tissus après une nouvelle méthode de désagrégation pour la peau Micro-Greffes Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Stratégique des cellules endothéliales Tube Formation Assay: Comparaison matrice extracellulaire et le facteur de croissance réduit la matrice extracellulaire

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Un test pour identifier les agonistes des récepteurs couplés aux protéines G, antagonistes et MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES cinétiques basés sur la Fluorescence Ca2 + mobilisation

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Enregistrement simultané de l’électrocardiographie et envahissantes sang pression mesure chez les Rats

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Enquêter sur la dégradation des barrières intestinales chez les organoïdes vivants

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...