Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Wir danken B. Spee für die großzügige Bereitstellung von LD540. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) an S.M.

Alle Hierbeschriebenen mit menschlichen Geweben wurden von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Utrecht (UMCU) genehmigt. Die informierte Zustimmung zur Gewebeentnahme, -erzeugung, -speicherung und -verwendung der Organoide wurde von Patienten der Wilhelmina-Kinderklinik (WKZ)-UMCU eingeholt.
1. Vorbereitung von Kulturmedien
HINWEIS: Dieses Protokoll sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Organoide sollten nach Stand...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der LD-Bildung bei menschlichen Darmorganoiden bei der Inkubation mit Ölsäure zur Verfügung. Diese Methode basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD54018, der eine Charakterisierung und Quantifizierung des Gesamtvolumens von Lipidtröpfchen innerhalb einer organoiden Kultur ermöglicht. Die Verfahren zur Etablierung und Erhaltung menschlicher Darmorganoidkulturen wurden vor13veröffentlicht, und ein visueller Le...

Lipide sind ein entscheidender Bestandteil der menschlichen Ernährung und spielen eine wichtige Rolle bei der systemischen Energiespeicherung und dem Stoffwechsel. Bei der Aufnahme werden diätetische Lipide durch Bauchspeicheldrüsenlipasen zu freien Fettsäuren (FFAs) und Monoglyceriden (MGs) abgebaut. Diese Substrate werden dann von den Enterozyten des Darmepithels aufgenommen, wo sie zunächst durch Monoglycerid-Acyltransferasen (MGAT)-Enzyme zu Diglyceriden (DG) und anschließend zu Triglyceriden (TG) durch Diacylglycerin reesterifiziert werden. Acyltransferase 1 (DGAT1)1. Schließlich sind diese TGs entweder in Chylomicrons für den Export in das Lymphsystem oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) für die intrazelluläre Lagerung2,3integriert. Obwohl Chylomicronen benötigt werden, um diätetische Lipide auf andere Organe zu verteilen, ist die Bedeutung der intrazellulären Fettspeicherung in LDs nicht ganz klar. Jedoch, LDs haben gezeigt, dass eine regulatorische Funktion im Darm zu erfüllen, wie sie langsam Lipide in den Kreislauf bis zu 16 h nach einer Mahlzeit4freisetzen. Darüber hinaus haben lDs gezeigt, dass sie vor toxischen Fettsäurekonzentrationen schützen, wie z. B. bei Mausadipozyten unter lipolytischen Bedingungen5.
Das DGAT1-Protein befindet sich auf der endoplasmatischen Retikulummembran (ER) und spielt eine entscheidende Rolle bei der LD-Bildung im Darmepithel. Homozygote Mutationen in DGAT1 führen zu früh auftretendem schweren Durchfall und/oder Erbrechen, Hypoalbuminämie und/oder (tödlicher) Proteinverlust-Enteropathie mit Darmversagen bei Fettaufnahme, was die Bedeutung von DGAT1 bei der Lipidhomöostase des Menschen Darmepithel6,7,8,9,10. Da das Auftreten von DGAT1-Mangel beim Menschen selten ist, ist der Zugang zu primären, vom Patienten abgeleiteten Zellen nur knapp. Darüber hinaus ist die Langzeitkultur der Darmepithelzellen seit langem auf tumorabgeleitete Zelllinien beschränkt, die die normale Physiologie nur bedingt darstellen. Daher wurde die DGAT1-vermittelte LD-Bildung meist in Fibroblasten oder tierischen Zelllinien7,10,11,12untersucht. Als solche wurde kürzlich gezeigt, dass DGAT1-defizienten Patienten-abgeleiteten Fibroblasten weniger LDs ansammeln als gesunde Kontrollzellen nach Stimulation mit Ölsäure (OA)8.
Zuvor wurden Protokolle zur Kultur epitheliale Stammzellen aus jedem Magen-Darm-Organ in Form von dreidimensionalen (3D) Organoiden13etabliert. Diese Darmorganoide können über einen längeren Zeitraum13in kulturerhalten und ermöglichen die funktionelle Untersuchung patienten- und darmortspezifischer Epithelmerkmale14. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und können gelagert werden, was eine langfristige Expansion und Biobanking13ermöglicht.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass LD-Bildung leicht in menschlichen Darmorganoiden in einem LD-Formationstest (LDF) Assay6gemessen werden kann. Wenn sie OA für 16 h ausgesetzt sind, erzeugen Organoide LDs, um die Zellen vor lipidinduzierter Toxizität zu schützen. Wenn die OA-Konzentrationen zu hoch sind, sterben die Zellen durch Caspase-vermittelte Apoptose6ab. Der LDF-Test war zuvor weitgehend von DGAT1 abhängig, wie durch Organoide von DGAT1-mutierten Patienten und durch die Verwendung von DGAT1-spezifischen Inhibitoren6angezeigt wurde.
Für den hier ausführlich beschriebenen LDF-Assay werden 3D-Organoide aus Darmbiopsien kultiviert und wöchentlich durch Unterbrechung in einzelne Zellen geleitet, die leicht neue Organoide bilden. Für den LDF-Assay werden in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte 7.500 organoidabgeleitete Einzelzellen plattiert. Organoide werden über mehrere Tage gebildet, über Nacht mit 1 mM OA inkubiert und mit LD540, einem fluoreszierenden zelldurchlässigen LD-spezifischen Farbstoff, der die Bildgebung erleichtert, gebeizt. Die LD-Bildung wird dann durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie quantifiziert.
Durch die Skalierung dieses LD-Formationstests auf ein 96-Well-Format kann der Assay auch für die Hochdurchsatzanalyse der LD-Bildung verwendet werden, um neuartige Medikamente zu untersuchen, die die LD-Bildung in menschlichen Darmorganoidkulturen beeinflussen, oder um (menschliche genetische) Störungen zu untersuchen, die LD-Stoffwechsel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Diätetische Lipide werden vom Darmepithel als freie Fettsäuren (FAs) aufgenommen. Diese FAs werden intrazellulär in Triglyceridmoleküle (TG) umgewandelt, bevor sie in Chylomikron für den Transport zur Lymphe oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) zur intrazellulären Lagerung verpackt werden. Ein entscheidender Schritt für die Bildung von LDs ist die katalytische Aktivität von Diacylglycerol-Acyltransferasen (DGAT) im letzten Schritt der TG-Synthese. LDs sind wichtig, um toxische Lipidarten zu puffern und den Zellstoffwechsel in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Da das menschliche Darmepithel regelmäßig mit hohen Lipidkonzentrationen konfrontiert wird, ist die LD-Bildung von großer Bedeutung, um die Homöostase zu regulieren. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur Charakterisierung und Quantifizierung der LD-Bildung (LDF) bei Stimulation mit der häufigsten ungesättigten Fettsäure, Ölsäure, bei menschlichen Darmorganoiden. Der LDF-Test basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540, der die Quantifizierung von LDs durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie ermöglicht. Der LDF-Assay kann verwendet werden, um die LD-Bildung in menschlichen Darmepithelzellen zu charakterisieren oder menschliche (genetische) Störungen zu untersuchen, die den LD-Stoffwechsel beeinflussen, wie DGAT1-Mangel. Darüber hinaus kann dieser Assay auch in einer Hochdurchsatz-Pipeline verwendet werden, um neuartige therapeutische Verbindungen zu testen, die Defekte in der LD-Bildung bei Darm- oder anderen Organoiden wiederherstellen.

Für eine ordnungsgemäße Analyse der LD-Bildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit OA und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden. Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Ein Beispiel für die richtige organoide Saatdichte (Abbildung 1A) und eine Kultur mit überlappenden Organoiden wird gezeigt (Abbil...

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A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Dieses Protokoll beschreibt einen Test für die Charakterisierung der Lipidtröpfchenbildung (LD) bei menschlichen Darmorganoiden bei Stimulation mit Fettsäuren. Wir diskutieren, wie dieser Assay für die Quantifizierung der LD-Bildung verwendet wird, und wie er für ein Hochdurchsatz-Screening für Medikamente verwendet werden kann, die die LD-Bildung beeinflussen.

Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Dieses Protokoll beschreibt einige Methoden zur Quantifizierung der Lipidtröpfchenbildung bei menschlichen Darmorganoiden. Es kann als Eine High-Throughput-Screening-Plattform verwendet werden, um auf Medikamente zu testen, die Lipid-Tröpfchenbildung modulieren. Die Von uns beschriebene Methode basiert auf einem Lipidtropfen-spezifischen Farbstoff und biopsieabgeleiteten Darmorganoiden.Es bietet damit ein stabiles, genaues und physiologisch relevantes Modell für die Lipidtröpfchenbildung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um patientenspezifische neuartige Arzneimittelkandidaten zu überprüfen, die die Bildung von Lipidtröpfchen modulieren, z. B. bei DGAT1-patienten. Diese Lipid-Tröpfchen-Bildung Assay kann auch auf andere Arten von organoiden Kulturen angewendet werden, um Lipidstoffwechsel in anderen Zelltypen zu studieren.Der Assay ist in erheblichem Maße von der Dichte der Organoidkultur abhängig. Versuchen Sie, eine konsistente Organoiddichte über Proben und Experimente hinweg zu gewährleisten. Visuelle Demonstration dieses Assays ist wichtig, weil es wichtig ist, zu zeigen, wie das Organoid kultiviert werden sollte und wie sie behandelt werden sollten, um eine ordnungsgemäße Analyse der Lipidtröpfchenbildung zu gewährleisten.Nach der Vorbereitung der Organoide, saugen Sie vorsichtig das Kulturmedium, ohne die Tröpfchen der Kellermembranmatrix zu stören. Fügen Sie 500 Mikroliter kaltes Basalmedium zum ersten Brunnen von Organoiden hinzu. Mit einer P1000 Pipette, sanft Pipette nach oben und unten, um die Keller Membran Matrix Tröpfchen mit Organoiden zu stören.Wiederholen Sie diese Verfahren mit dem gleichen Medium im nächsten gut wie erforderlich, aber ernten Sie nicht mehr als zwei Brunnen pro 500 Mikroliter Basalmedium. Sammeln Sie die Organoide in einem niedrig bindenden 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie sie 15 bis 20 Sekunden lang in einer Mini-Tischzentrifuge nach unten. Fügen Sie 400 Mikroliter Trypsin zu den gesponnenen Organoiden hinzu.In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Verwenden Sie als Nächstes eine P200-Pipette, um die Suspension vorsichtig nach oben und unten zu pipetten, um die verbleibenden Aggregate der Zellen zu stören. In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren.Wenn nur noch einzelne Zellen übrig sind, fügen Sie einen Milliliter Basalmedium hinzu, und drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 Sekunden herunter. Aspirieren Sie den Überstand vollständig. Verwenden Sie eine P200 Pipetten, um die einzelnen Zellen in 200 Mikrolitern frischer hSI-EM wieder aufzuhängen, und fügen Sie weitere 800 Mikroliter hSI-EM hinzu.Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen in der Suspension und berechnen Sie das Volumen der Zellen, die für die endgültige Zelldichte benötigt werden. Nehmen Sie das entsprechende Suspensionsvolumen heraus und passen Sie die Dichte auf 750 Zellen pro Mikroliter an. Fügen Sie der Zellsuspension eine Kellermembranmatrix im Verhältnis von zwei zu eins hinzu.Sanft Pipette die Suspension zu mischen, vorsichtig zu vermeiden, Blasen zu vermeiden. In einer vorgewärmten Kulturplatte drei 10-Mikroliter-Tröpfchen pro Brunnen aussäen, wenn die Platte 24 Brunnen oder ein Fünf-Mikroliter-Tröpfchen pro Brunnen hat, wenn die Platte 96 Brunnen hat. Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für 10 bis 15 Minuten, um die Tröpfchen zu erstarren.In einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius ein entsprechendes Volumen von hSI-EM+Y vorwärmen. Danach den vorgewärmten hSI-EM+Y vorsichtig in jeden Brunnen der Platte geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.Ersetzen Sie das Medium nach zwei bis drei Tagen durch hSI-EM und aktualisieren Sie es zwei- bis dreimal pro Woche. Erstens, wiegen Sie 0,2 Gramm flüssige Ölsäure bei Raumtemperatur. 1,5 Milliliter kulturtaugliches steriles PBS hinzufügen und das Gemisch eine Stunde lang auf 70 Grad Celsius erhitzen und dafür sorgen, dass es zeitweise vorstößt.Als nächstes wiegen Sie 5,89 Gramm fettsäurefreie BSA und lösen Sie sie in 33,9 Milliliter PBS auf. Erwärmen Sie die Mischung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, bis die BSA vollständig aufgelöst ist. Die Ölsäuremischung wieder zu einer Emulsion feiner Tröpfchen zu versenken und sofort mit einer Glaspipette in die BSA-Lösung einzubauen.Halten Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, bis eine klare gelbliche Lösung bleibt. Durchgehen sie die Organoide, wie zuvor beschrieben, und säen Sie die organoiden Einzelzellen in eine schwarze Klarbodenplatte 96-Well aus. Ersetzen Sie am sechsten Tag der Kultivierung auf hSI-EM das Kulturmedium durch hSI-EM, das einen Millimolar der Ölsäure und des BSA-Konjugats enthält.Inkubieren Sie die Zellen für 16 bis 17 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 mikromolaren DGAT1-Inhibitoren. Danach das Medium ansaugen, ohne die Kellermembran-Matrixtröpfchen zu stören. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie 100 Mikroliter von vier Prozent neutral gepuffertem Formaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur in die Brunnen einfügen.Entfernen Sie das Formaldehyd vorsichtig und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 150 Mikroliter PBS pro Brunnen. Stain die Zellen für Lipidtröpfchen mit 025 Milligramm pro Milliliter LD540 und DAPI in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dann waschen Sie die Brunnen sorgfältig mit PBS.Für Übersichtsbilder ganzer Organoide wird ein 40-fach subjektives verwendet, das für konfokale Fluoreszenzaufnahmen geeignet ist. Stellen Sie das Mikroskop auf ein Bild für DAPI und den LD540-Farbstoff mithilfe der hier gezeigten Anregungs- und Emissionseinstellungen ein. Stellen Sie die Lochgröße auf eine luftige Einheit für eine ausreichende Z-Achsen-Auflösung ein.Um die Hälfte eines kugelförmigen Organoids abzubilden, stellen Sie einen Z-Stack auf ca. 85 Mikrometer ein. Verwandeln Sie mithilfe eines geeigneten Bildverarbeitungssystems den Z-Stack jedes Organoids in eine maximale Projektion, indem Sie auf Bild, Stapel, Z-Projekt klicken. Legen Sie den Schwellenwert für die maximale Projektion auf einen Wert fest, in dem kein LD540-Signal in der BSA-Fahrzeugsteuerungsstichprobe sichtbar ist, indem Sie auf Bild, Anpassen, Schwellenwert klicken.Verwenden Sie diese Einstellungen, um jedes Bild zu beschumen. Messen Sie dann die Gesamtfluoreszenzfläche für jede maximale Projektion mit der Funktion Analysieren, Partikel analysieren. Für eine ordnungsgemäße Analyse der Lipidtröpfchenbildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit Ölsäure und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden.Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Nach der Stimulation mit einem Millimolar Ölsäure über Nacht kann die Lipidtröpfchenbildung mit einem invertierten Hellfeldmikroskop visualisiert werden. Die Ansammlung von Lipidtröpfchen streut das übertragene Licht, und daher erscheinen die Organoide dunkler, während nicht stimulierte Organoide ein durchscheinendes Aussehen haben.Sobald die Ölsäure-stimulierten Organoide fixiert und gebeizt sind, kann die Lipidtröpfchenbildung mit einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden. Da es sich bei den Organoiden um 3D-Strukturen handelt, ist ein regelmäßiges Epifluoreszenzmikroskop aufgrund des außerfokussierten Hintergrundsignals nicht geeignet, so dass ein konfokaler Z-Stack verwendet wird, um LDF in Organoiden zu charakterisieren. Die Quantifizierung der konfokalen Mikroskopieproben kann auch mit einem auf das fluoreszierende Hoechst-Signal normalisierten Fluoreszenzplattenleser durchgeführt werden.Der Plattenleser-Assay zeigt eine signifikante Abnahme des LD540-Signals in Organoidzellen, die mit DGAT1-Hemmer behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Organoiden. Die Quantifizierung der LD-Bildung in einzelnen Zellen kann mit einem Durchflusszytometer erreicht werden. Die hier gezeigte Gating-Strategie ist für dissoziierte menschliche Darmorganoide.Repräsentative Histogramme sowohl für das SSC-A als auch für das LD540-Signal der letzten Lebenden Zellpopulation zeigen, dass die Lipidtröpfchenbildung aufgrund der Bildung von intrazellulären Lipidtröpfchen zu einer Zunahme von SSC-A führen wird. Darüber hinaus LD540 Flecken für Lipide, die in den Lipidtröpfchen gespeichert sind, und das Signal wird auch auf die Induktion der Lipidtröpfchen Bildung erhöhen. Als solche wird die Lipidtröpfchenbildung als Verschiebung der mittleren fluoreszierenden Intensität von SSC-A und LD540 gemessen.Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die Kultur der menschlichen Darmorganoide und die richtige Wellung von Ölsäure zu BSA. Um mehr Bedingungen zu erfüllen, kann dieser Test mit einem Fluoreszenzplattenleser analysiert werden. Um die Organoidzahl pro Bohrwert zu korrigieren, wurde das LD540-Signal auf das DAPI-Signal normalisiert.Mit dieser Technik können Forscher die Lipidtröpfchenbildung in Organoidsystemen untersuchen und verschiedene Analysetechniken wie die Elektronenmikroskopie verbessern, um ihre Ergebnisse zu validieren.

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