Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

אנו מודים ב. Spee על מתן בנדיבות LD540. עבודה זו נתמכה על ידי ארגון הולנד להענקת מחקר מדעי (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) לס

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות שתוארו במסמך זה אושרו על ידי הוועדה האתית במרכז הרפואי האוניברסיטאי אוטרכט (UMCU). הסכמה מושכלת לאיסוף רקמות, הדור, האחסון והשימוש באורגנואידים הושגו ממטופלים בבית החולים לילדים וילהלמינה (WKZ)-UMCU.
1. הכנת המדיה התרבותית
הערה:...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לקבוע את היווצרות LD במעי האנושי אורגנואידים על הדגירה עם חומצה אולאית. שיטה זו מבוססת על LD ספציפי לצבוע פלורסנט LD54018, אשר מאפשר אפיון וכימות של הנפח הכולל של טיפות השומנים בתוך תרבות אורגאידית. ההליכים להקמת ולתחזוקה של תרבויות בעלי מעיים אנושיים פ...

שומנים הם מרכיב חיוני של התזונה האנושית ולשחק תפקיד חשוב אחסון אנרגיה מערכתית ומטבוליזם. כאשר בלע, ליפידים תזונתיים הם מושפל לתוך חומצות שומן בחינם (FFAs) ו monoglycerides (MGs) על ידי lipases הלבלב. מצעים אלה נלקחים לאחר מכן על ידי הנוציטים של האפיתל המעי, שם הם הראשונים מחדש לדיגלידים (DG) על ידי אנזימים מונגליד (MGAT) ולאחר מכן לטריגליצרידים (TG) על ידי diacylגליצרול (DGAT1)1. לבסוף, האלה משולבים ב-טי. אס. או chylomicrons לייצוא למערכת הלימפה או טיפות השומנים ציטוסולג (השלד) עבור אחסון תאיים2,3. למרות שchylomicrons נחוצים להפצת שומנים תזונתיים לאיברים אחרים, החשיבות של אחסון שומן תאיים ב-השלד אינה ברורה לחלוטין. עם זאת, המכונה הוכחו לבצע פונקציה תקינה במעי, כפי שהם לאט לשחרר שומנים לתוך המחזור עד 16 h אחרי ארוחה4. יתר על כן, המוני הוכחו להגן מפני ריכוזי חומצות שומן רעילים, כגון במהלך התנאים לפני העכבר5.
חלבון DGAT1 ממוקם על הממברנה האנדופלזמית (ER) וממלא תפקיד מכריע ב-LD היווצרות ב אפיתל המעי. מוטציות Homozygous ב DGAT1 להוביל שלשול מוקדם התפרצות חמורה ו/או הקאות, היפואלבומין, ו/או (קטלני) חלבון מאבד בידור עם כישלון מעיים על צריכת שומן, הממחישות את החשיבות של DGAT1 הומאוסטזיס השומנים של האדם , אפיתל המעי6,7,8,9,10 מאז התרחשות של DGAT1-מחסור בבני אדם הוא נדיר, הגישה לתאים שנגזר מטופל הראשי כבר נדיר. יתר על כן, התרבות ארוכת טווח של תאים אפיתל המעי כבר זמן רב מוגבלת קווי הגידול נגזר התאים אשר מייצגים את הפיזיולוגיה נורמלי רק להאריך מוגבל. לכן, היווצרות DGAT1-בתיווך LD למדו בעיקר בפיברותקיעות או בעלי חיים שמקורם שורות תא7,10,11,12. בתור כזה, זה היה לאחרונה הראו כי DGAT1-לקויה מטופלים נגזר פיברוטים לצבור פחות התעודות לעומת תאים בריאים לאחר גירוי עם חומצה אולאית (OA)8.
בעבר, פרוטוקולים הוקמו בתאי גזע האפיתל התרבות מכל איבר העיכול בצורה של תלת מימדי (3D) אורגנואידים13. מעיים אלה ניתן לשמור בתרבות במשך תקופה ארוכה של13, ולאפשר את המחקר הפונקציונלי של המטופל-ואת המעיים מיקום ספציפי מאפיינים האפיתל14. הם גנטית, פנופנטיות בדרך כלל יציבה וניתן לאחסן, המאפשר הרחבה ארוכת טווח ו biobanking13.
לאחרונה הדגמנו כי היווצרות LD ניתן למדוד בקלות בתוך אורגנואידים המעי האנושי במערך LD (LDF) שיטת6. כאשר הם חשופים OA עבור 16 h, אורגנואידים ליצור התעודות כדי להגן על התאים מפני רעילות המושרה ליפיד. כאשר ריכוזי OA גבוהים מדי, התאים מתים על ידי caspase-תיווך ואפופטוזיס6. שיטת LDF הוצגה בעבר להיות תלויה במידה רבה ב DGAT1 כפי שצוין על ידי אורגנואידים נגזר מהחולים DGAT1-מוטנטים ועל ידי שימוש במעכבי DGAT1 ספציפיים6.
עבור שיטת ה-LDF המתוארת בפירוט כאן, אורגנואידים תלת-ממדיים הם מתורבתים מפני ביופסיות מעיים ומהווים שבועי באמצעות הפרעה לתאים בודדים היוצרים בקלות אורגנואידים חדשים. עבור הפעלת שיטת LDF, ~ 7,500 התאים היחידים הנגזרים אורגאיד מצופים בכל טוב של צלחת 24-הבאר. אורגנואידים נוצרות לאורך מספר ימים, מודלבן לילה עם OA 1 מ"מ ו ויטראז ' עם LD540, תא פלורסנט-מוגדר-LD לצבוע ספציפי המקל הדמיה. היווצרות LD הוא לאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לוחית הפלורסנט קורא, או לזרום cy, לנסות.
על-ידי שינוי קנה מידה זה היווצרות זיהוי LD לפורמט 96-ובכן, הטיפול יכול לשמש גם עבור ניתוח תפוקה גבוהה של היווצרות LD למסך תרופות הרומן המשפיעות על היווצרות LD בתרבויות המעי האנושי מחלות, או ללמוד (האדם הגנטי) הפרעות המשפיעות על . מטבוליזם של LD

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

ליפידים תזונתיים נלקחים כמו חומצות שומן חינם (בדרך) על ידי אפיתל המעי. אלה מintracellularly המרה לתוך הטריגליצרידים (TG) מולקולות, לפני שהם ארוזים לתוך chylomicrons לצורך הובלה לימפה או לתוך השומנים טיפות ציטוסולג (המוני) עבור אחסון תאיים. צעד מכריע עבור היווצרות של ה-"השלד" הוא הפעילות הקטליטית של הדיליליגליל (DGAT) בשלב הסופי של הסינתזה TG. המורדים חשובים לחיץ מינים רעילים השומנים ולווסת את חילוף החומרים הסלולרי בסוגי תאים שונים. מאז אפיתל המעי האנושי הוא התעמת באופן קבוע עם ריכוזים גבוהים של שומנים, היווצרות LD הוא בעל חשיבות רבה כדי לווסת הומאוסטזיס. כאן אנו מתארים את הבקשה הפשוטה לאפיון וככמת של היווצרות LD (LDF) על גירוי עם חומצת שומן בלתי רווי הנפוץ ביותר, חומצה אולאית, ב אורגנואידים המעי האנושי. שיטת ה-ldf מבוססת על הצבע הפלורסנט הספציפי LD LD540, אשר מאפשר כימות של הזדהות על ידי קונפוקלית מיקרוסקופ מיקוד, הקורא צלחת הפלורסנט, או הזרימה cy, try. שיטת LDF ניתן להשתמש כדי לאפיין את היווצרות LD בתאי האפיתל המעי האנושי, או ללמוד אנושי (גנטי) הפרעות המשפיעות על מטבוליזם LD, כגון DGAT1 מחסור. יתר על כן, ניתן להשתמש באפשרות זו גם בצינור תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרכובות טיפוליות הרומן, אשר לשחזר פגמים ביצירת LD במעיים או סוגים אחרים של אורגנואידים.

לניתוח הנכון של היווצרות LD, האורגנואידים לא צריך להיות הנזרע בצפיפות רבה לפני גירוי עם OA והכתים הבאים. הדבר מהווה חשיבות במיוחד עבור מוקד הקריאה וקורא הצלחות, כיוון שהאורגנואידים החופפים עלולים להפריע לזריחה. דוגמה לצפיפות מתאימה של זריעה אורגאידית (איור 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

פרוטוקול זה מתאר את התצורה של היווצרות droplet (LD) של השומנים במבנה המעי האנושי על גירוי עם חומצות שומן. אנו דנים כיצד משתמשים באותה שיטת לכימות היווצרות LD, וכיצד ניתן להשתמש בה עבור הקרנת תפוקה גבוהה עבור תרופות המשפיעות על היווצרות LD.

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות לכמת היווצרות טיפת השומנים באורגנואידים מעיים אנושיים. זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרופות לווסת היווצרות טיפת השומנים. השיטה שאנו מתארים מבוססת על צבע ספציפי לירידה בדם ואיברנואידים מעיים שמקורם בביופסיה.בכך הוא מספק מודל יציב, מדויק ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית להיווצרות טיפות שומנים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לסנן עבור מועמדים תרופה חדשה ספציפית למטופל לווסת את היווצרות טיפות השומנים, למשל, בחולים DGAT1-לקוי. זה טיפת השומנים היווצרות assay יכול להיות מיושם גם על סוגים אחרים של תרבויות organoid ללמוד חילוף החומרים השומנים בסוגי תאים אחרים.ההתמהמה תלויה במידה ניכרת בצפיפות התרבות האורגנואידית. נסו להבטיח צפיפות אורגנואידית עקבית בין דגימות וניסויים. הדגמה חזותית של בדיקה זו היא קריטית משום שחשוב להראות כיצד האורגנואיד צריך להיות מתורבת וכיצד יש לטפל בהם כדי להבטיח ניתוח נכון של היווצרות טיפת השומנים.לאחר הכנת האורגנואידים, שאף בזהירות את מדיום התרבות מבלי להפריע ל טיפות מטריצת קרום המרתף. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום בסיס קר ל הבאר הראשונה של אורגנואידים. באמצעות פיפטה P1000, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את טיפות מטריצת קרום המרתף עם אורגנואידים.חזור על הליכים אלה עם אותו מדיום הבא גם נדרש, אבל לא לקצור יותר משתי בארות לכל 500 microliters של מדיום בסיס. לאסוף את האורגנואידים בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר מחייב נמוך, ולסובב אותם למטה בצנטריפוגה שולחן מיני במשך 15 עד 20 שניות. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של טריפסין לאורגנואידים המסובבים.דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה P200 כדי pipette בעדינות את ההשעיה למעלה ולמטה כדי לשבש את הצבירה הנותרת של תאים. דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.כאשר רק תאים בודדים נשארים, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום בסיס ומסובבים כלפי מטה את התאים בצנטריפוגה קטנה לשולחן למשך 15 עד 20 שניות. שאף את העל-טבעי לחלוטין. השתמשו בפיפט P200 כדי להשעות מחדש את התאים הבודדים ב-200 מיקרוליטרים של hSI-EM טרי, ולהוסיף 800 מיקרוליטרים נוספים של hSI-EM.לאחר מכן ספור את מספר התאים בהשעיה וחשב את נפח התאים הדרוש לצפיפות התאים הסופית. מוציאים את נפח המתלים המתאים ומתאימים את הצפיפות ל-750 תאים למיקרוליטר. הוסף מטריצת קרום מרתף לתליית התא ביחס של 2 ל-1.בעדינות pipette ההשעיה לערבב להיות זהיר כדי למנוע יצירת בועות. בצלחת תרבות מחוממת מראש, זרע את שלוש טיפות 10 מיקרוליטר לגם אם הצלחת יש 24 בארות או טיפה אחת חמישה מיקרוליטר לגם אם הצלחת יש 96 בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 10 עד 15 דקות כדי לחזק את טיפות.בינתיים, מחממים מראש נפח מתאים של hSI-EM+Y באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות את hSI-EM+Y החם מראש לכל באר של הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני.לאחר יומיים עד שלושה ימים, החלף את המדיום ב- hSI-EM ודאג לרענן אותו פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. ראשית, לשקול 0.2 גרם של חומצה אולאית נוזלית בטמפרטורת החדר. מוסיפים 1.5 מיליליטר של PBS סטרילי ברמה תרבותית ומחממים את התערובת ל-70 מעלות צלזיוס למשך שעה ומוודאים מערבולת לסירוגין.לאחר מכן, לשקול 5.89 גרם של BSA ללא חומצות שומן ולהמיס אותו 33.9 מיליליטר של PBS. מחממים את התערובת באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה של ה-BSA. Vortex תערובת חומצה אולאית שוב כדי ליצור אמולסיה של טיפות בסדר מיד להוסיף אותו לפתרון BSA באמצעות פיפטה זכוכית.שומרים את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד פתרון צהבהב ברור נשאר. מעבר האורגנואידים כפי שתואר בעבר וזרע את התאים הבודדים שמקורם באורגנואידים לתוך צלחת שחורה ברורה 96 באר. ביום השישי של culturing על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל מילימול אחד של חומצה אולאית BSA מצומד.דגירה התאים במשך 16 עד 17 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות או היעדר 0.1 מעכבי DGAT1 מיקרומולרי. לאחר מכן, שאף את המדיום מבלי להפריע טיפות מטריצת קרום המרתף. לקבע את האורגנואידים על ידי הוספת 100 microliters של ארבעה אחוז ניטרלי מאגר פורמלדהיד ל בארות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.הסר את פורמלדהיד בעדינות ובזהירות לשטוף את התאים עם 150 microliters של PBS ל הבאר. להכתים את התאים עבור טיפות השומנים עם 025 מיליגרם למיליליטר LD540 ו DAPI ב PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. ואז לשטוף את הבארים בזהירות עם PBS.לתמונות סקירה של אורגנואידים שלמים יש להשתמש בסובייקטיבי פי 40 שמתאים להדמיה פלואורסצנטית קונפוקל. הגדר את המיקרוסקופ לתמונה עבור DAPI וצבע LD540 באמצעות הגדרות העירור וההפחתה המוצגות כאן. הגדר את גודל חור הסיכה ליחידה אווריורית אחת לקבלת רזולוציה מספקת של ציר z.כדי לדמיין חצי של אורגנואיד כדורי להגדיר z-מחסנית כ 85 מיקרומטר. באמצעות מערכת עיבוד תמונה מתאימה, שנה את ערימת z של כל אורגנואיד להקרנה מרבית על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות, פרוייקט Z. הגדר את סף ההקרנה המרבית לרמה שבה אין אות LD540 גלוי בדגימה של בקרת רכב BSA על-ידי לחיצה על תמונה, כוונון, סף.השתמש בהגדרות אלה כדי לסף כל תמונה. לאחר מכן למדוד את השטח הכולל של פלואורסצנטיות עבור כל הקרנה מקסימלית באמצעות הפונקציה לנתח, לנתח חלקיקים. לניתוח נכון של היווצרות טיפת השומנים, האורגנואידים לא צריכים להיות זרע בצפיפות מדי לפני גירוי עם חומצה אולאית וכתמים הבאים.זה חשוב במיוחד עבור הקריאה קונפוקל קורא צלחת מאז אורגנואידים חופפים עלול להפריע פלואורסצנטיות. לאחר גירוי עם מילימולר אחד של חומצה אולאית בן לילה, היווצרות טיפת השומנים ניתן לדמיין עם מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. הצטברות של טיפות שומנים מפזרת אור מועבר, ולכן האורגנואידים נראים כהים יותר, ואילו אורגנואידים שאינם מגורים יש מראה שקוף.לאחר האורגנואידים המושרים בחומצה אולאית קבועים ומוכתמים, ניתן לדמיין את היווצרות טיפת השומנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. מכיוון שהאברנואידים הם מבנים תלת-מימדיים, מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רגיל אינו מתאים בשל אות הרקע מחוץ לפוקוס, ולכן נעשה שימוש בערימה קונפוקלית כדי לאפיין LDF באורגנואידים. כימות של דגימות מיקרוסקופיה confocal יכול להתבצע גם באמצעות קורא לוח פלואורסצנטי מנורמל לאות Hoechst פלואורסצנטי.מסמן קורא הלוחות מצביע על ירידה משמעותית באות LD540 בתאי אורגנואידים שטופלו במעכב DGAT1 בהשוואה לאורגנואידים לא מטופלים. כימות של היווצרות LD בתאים בודדים ניתן להשיג באמצעות ציטומטר זרימה. אסטרטגיית הגתה המוצגת כאן היא לאיברואידים מעיים אנושיים נותק.היסטוגרמות נציג עבור שניהם SSC-A ואת האות LD540 של אוכלוסיית התא החי הסופי להראות כי היווצרות טיפת השומנים יגרום לעלייה SSC-A עקב היווצרות של טיפות שומנים תאיים. בנוסף, כתמי LD540 עבור שומנים המאוחסנים טיפות השומנים, ואת האות גם יגדל עם אינדוקציה של היווצרות טיפת השומנים. ככזה, היווצרות טיפת השומנים נמדדת כשינוי בעוצמת הפלואורסצנט הממוצעת של SSC-A ו- LD540.הצעדים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הם התרבות של אורגנואידים מעיים אנושיים ואת גלית נכונה של חומצה אולאית ל- BSA. כדי להתאים לתנאים נוספים, ניתן לנתח את ההתראה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. כדי לתקן עבור מספר האורגנואיד ל באר, אות LD540 היה מנורמל לאות DAPI.בעזרת טכניקה זו, חוקרים יכולים לחקור היווצרות טיפות שומנים במערכות אורגנואידיות, ולשפר טכניקות ניתוח שונות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאמת את הממצאים שלהם.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

ההקלטה סימולטני אלקטרוקרדיוגרם ודם פולשנית בלחץ מדידה בחולדות

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...