Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Ringraziamo B. Spee per aver generosamente fornito LD540. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-eonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.

Tutte le sperimentazioni con tessuti umani qui descritti sono state approvate dal comitato etico dell'University Medical Center Utrecht (UMCU). Il consenso informato per la raccolta, la generazione, lo stoccaggio e l'uso degli organoidi è stato ottenuto dai pazienti presso l'Ospedale pediatrico Wilhelmina (WK) -UMCU.
1. Preparazione dei mezzi di coltura
 NOT:</</c0> Questo protocollo deve essere eseguito all'interno di un armadio di biosicurezza. Gli organoid...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Qui, forniamo un protocollo per determinare la formazione di LD negli organoidi intestinali umani in caso di incubazione con acido oleico. Questo metodo si basa sul coloranti fluorescente LD54018specifico di LD, che consente la caratterizzazione e la quantificazione del volume totale delle goccioline lipidiche all'interno di una coltura organoide. Le procedure per stabilire e mantenere le colture organoide intestinali umane sono state pubblicate prima delle13,ed è disponib...

I lipidi sono una componente cruciale della dieta umana e svolgono un ruolo importante nello stoccaggio e nel metabolismo dell'energia sistemica. Quando ingeriti, i lipidi dietetici vengono degradati in acidi grassi liberi (FFA) e monogliceridi (MG) da lipasi pancreatici. Questi substrati vengono poi assorbiti dagli enterociti dell'epitelio intestinale, dove vengono prima ri-esterismi a diglycerides (DG) da enzimi di aciltrasferidi monoglicetri (MGAT) e successivamente ai trigliceridi (TG) dal diacilglicerolo acyltransferase 1 (DGAT1)1. Infine, questi TG sono integrati in chilomicroni per l'esportazione nel sistema linfatico o goccioline lipidici citosoliche (LD) per l'immagazzinamento intracellulare2,3. Anche se i chilomicron sono necessari per distribuire i lipidi dietetici ad altri organi, l'importanza dell'immagazzinamento di grasso intracellulare nelle LD non è completamente chiara. Tuttavia, gli LD hanno dimostrato di svolgere una funzione regolatore nell'intestino, in quanto rilasciano lentamente i lipidi nella circolazione fino a 16 h dopo un pasto4. Inoltre, gli LD hanno dimostrato di proteggere contro le concentrazioni di acidi grassi tossici, come negli adipociti del topo durante le condizioni lipolisite5.
La proteina DGAT1 si trova sulla membrana del reticolo endoplasmico (ER) e svolge un ruolo cruciale nella formazione di LD nell'epitelio intestinale. Le mutazioni omozygose nel DGAT1 portano a diarrea grave e/o vomito, ipoalbuminemia e/o enteropatia (fatale) di proteine con insufficienza intestinale all'assunzione di grassi, illustrando l'importanza del DGAT1 nell'omeostasi lipidica dell'uomo epitelio intestinale6,7,8,9,10. Poiché il verificarsi di carenza di DGAT1 negli esseri umani è raro, l'accesso alle cellule primarie derivate dal paziente è stato scarso. Inoltre, la coltura a lungo termine delle cellule epiteliali intestinali è stata a lungo limitata alle linee cellulari derivate dal tumore che rappresentano la fisiologia normale solo in misura limitata. Pertanto, la formazione di LD mediata da DGAT1 è stata studiata principalmente nei fibroblasti o nelle linee cellulari di origine animale7,10,11,12. Come tale, è stato recentemente dimostrato che i fibroblasti derivati dal paziente Degrado di DGAT1 accumulano meno LD rispetto alle cellule di controllo sane dopo la stimolazione con acido oleico (OA)8.
In precedenza, sono stati stabiliti protocolli per coltura cellule staminali epiteliali da qualsiasi organo gastrointestinale sotto forma di organoidi tridimensionali (3D)13. Questi organoidi intestinali possono essere tenuti in coltura per un lungo periodo di tempo13, e consentire lo studio funzionale delle caratteristiche epiteliali specifiche del paziente e del luogo intestinale14. Sono geneticamente e fenotipicamente stabili e possono essere immagazzinati, consentendo l'espansione a lungo termine e il biobanking13.
Recentemente abbiamo dimostrato che la formazione di LD può essere facilmente misurata negli organoidi intestinali umani in un assaggioLD(LDF) 6 . Quando esposti a OA per 16 h, gli organoidi generano LD per proteggere le cellule dalla tossicità indotta dai lipidi. Quando le concentrazioni di OA sono troppo elevate, le cellule muoiono per apoptosi mediata dalla caspasi6. Il saggio LDF è stato precedentemente dimostrato essere in gran parte dipendente dal DGAT1 come indicato dagli organoidi derivati da pazienti mutanti DGAT1 e dall'uso di inibitori specifici di DGAT16.
Per il saggio LDF descritto in dettaglio qui, gli organoidi 3D sono coltivati da biopsie intestinali e vengono passati settimanalmente da interruzioni in singole cellule che formano facilmente nuovi organoidi. Per l'esecuzione del saggio LDF, 7.500 celle singole derivate da organoidi sono placcate in ogni pozzo di una piastra di 24 pozze. Gli organiidi si formano nel corso di diversi giorni, incubati durante la notte con 1 mM OA e macchiati con LD540, un coloranti fluorescente specifico per le cellule LD che facilita l'imaging. La formazione di LD viene quindi quantificata mediante microscopia confocale, lettore di piastre fluorescenti o citometria a flusso.
Scalando questo saggio di formazione LD in un formato di 96 pozzi, l'analisi può essere utilizzato anche per l'analisi ad alta velocità della formazione di LD per lo screening di nuovi farmaci che influenzano la formazione di LD nelle colture organoidi intestinali umane, o per studiare disturbi (genetici umani) che colpiscono metabolismo LD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

I lipidi dietetici sono assunti come acidi grassi liberi (FU) dall'epitelio intestinale. Queste FA sono convertite intracellulare in molecole di trigliceridi (TG), prima di essere confezionate in chylomicron per il trasporto alla linfa o in goccioline lipidiche citosoliche (LD) per lo stoccaggio intracellulare. Un passo cruciale per la formazione dei LD è l'attività catalitica degli acylglycerol acyltransferases (DGAT) nella fase finale della sintesi TG. Gli LD sono importanti per tamponare le specie di lipidi tossiche e regolare il metabolismo cellulare in diversi tipi di cellule. Poiché l'epitelio intestinale umano si confronta regolarmente con alte concentrazioni di lipidi, la formazione di LD è di grande importanza per regolare l'omeostasi. Qui descriviamo un semplice saggio per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di LD (LDF) sulla stimolazione con l'acido grasso insaturi più comune, l'acido oleico, negli organoidi intestinali umani. L'analisi LDF si basa sul colorante fluorescente LD LD, che consente la quantificazione degli LD mediante microscopia confocale, lettore di lastre fluorescenti o citometria a flusso. L'analisi LDF può essere utilizzata per caratterizzare la formazione di LD nelle cellule epiteliali intestinali umane, o per studiare disturbi umani (genetici) che influenzano il metabolismo dell'LD, come la carenza di DGAT1. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato anche in una pipeline ad alta produttività per testare nuovi composti terapeutici, che ripristinano i difetti nella formazione di LD in intestinali o altri tipi di organoidi.

Per una corretta analisi della formazione di LD, gli organoidi non devono essere semipati troppo densamente prima della stimolazione con OA e successiva colorazione. Ciò è particolarmente importante per la lettura del lettore confocale e della piastra, poiché gli organoidi sovrapposti potrebbero interferire con la fluorescenza. Viene illustrato un esempio di corretta densità di seeding degli organididi ( Figura 1A) e di unacolturacon orga...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Questo protocollo descrive un saggio per la caratterizzazione della formazione di goccioline lipidi (LD) negli organoidi intestinali umani dopo la stimolazione con acidi grassi. Discutiamo di come questo saggio viene utilizzato per la quantificazione della formazione di LD, e come può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività per i farmaci che influenzano la formazione di LD.

Un saggio basato sulla fluorescenza per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di gocciolini di lipidi negli organiidi intestinali umani

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Questo protocollo descrive alcuni metodi per quantificare la formazione di goccioline lipidiche negli organoidi intestinali umani. Può essere utilizzato come piattaforma di screening ad alta produttività per testare i farmaci che modulano la formazione di goccioline lipidiche. Il metodo che descriviamo si basa su un colorante specifico per goccioline lipidiche e organoidi intestinali derivati dalla biopsia.Fornisce così un modello stabile, accurato e fisiologicamente rilevante per la formazione di goccioline lipidiche. Questo protocollo può essere utilizzato per lo schermo per i nuovi candidati ai farmaci specifici del paziente che modulano la formazione di goccioline lipidiche, ad esempio, in pazienti carenti di DGAT1. Questo saggio di formazione di goccioline lipidiche può anche essere applicato ad altri tipi di colture organoidi per studiare il metabolismo lipidico in altri tipi di cellule.Il saggio dipende in larga misura dalla densità della coltura organoide. Cerca di garantire una densità organoide costante tra campioni ed esperimenti. La dimostrazione visiva di questo saggio è fondamentale perché è importante mostrare come l'organoide dovrebbe essere coltivato e come dovrebbe essere gestito per garantire una corretta analisi della formazione di goccioline lipidiche.Dopo aver preparato gli organoidi, aspirare attentamente il mezzo di coltura senza disturbare le goccioline della matrice della membrana basale. Aggiungere 500 microlitri di mezzo basale freddo al primo pozzo di organoidi. Utilizzando una pipetta P1000, pipettare delicatamente su e giù per interrompere le goccioline a matrice di membrana sotterranea con organoidi.Ripetere queste procedure con lo stesso mezzo nel prossimo e richiesto, ma non raccogliere più di due pozzi per 500 microlitri di mezzo basale. Raccogliere gli organoidi in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri a bassa legatura e farli girare verso il basso in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 secondi. Aggiungere 400 microlitri di triptina agli organoidi spun-down.Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta P200 per pipettare delicatamente la sospensione su e giù per interrompere gli aggregati rimanenti di celle. Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Quando rimangono solo singole cellule, aggiungere un millilitro di mezzo basale e far girare le cellule in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 secondi. Aspirare completamente il supernatante. Utilizzare una pipetta P200 per sospendere di nuovo le singole celle in 200 microlitri di hSI-EM fresco e aggiungere altri 800 microlitri di hSI-EM.Quindi contare il numero di celle in sospensione e calcolare il volume di celle necessarie per la densità cellulare finale. Esettare il volume appropriato di sospensione e regolare la densità a 750 celle per microlitro. Aggiungere la matrice della membrana basale alla sospensione cellulare in un rapporto di due a uno.Pipettare delicatamente la sospensione per mescolare facendo attenzione a evitare di creare bolle. In una piastra di coltura pre-riscaldata, seminare tre goccioline da 10 microliter per pozzo se la piastra ha 24 pozzetti o una goccia a cinque microliter per pozzo se la piastra ha 96 pozzi. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica per 10-15 minuti per solidificare le goccioline.Nel frattempo, pre-riscaldare un volume appropriato di hSI-EM +Y in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopodiché, aggiungere con cura l'hSI-EM+Y pre-riscaldato ad ogni pozza della piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica.Dopo due o tre giorni, sostituire il supporto con hSI-EM e assicurarsi di aggiornarlo da due a tre volte a settimana. In primo luogo, pesare 0,2 grammi di acido oleico liquido a temperatura ambiente. Aggiungere 1,5 millilitri di PBS sterile di grado coltura e riscaldare la miscela a 70 gradi Celsius per un'ora assicurandosi di vortice a intermittenza.Successivamente, pesare 5,89 grammi di BSA privo di acidi grassi e scioglierlo in 33,9 millilitri di PBS. Riscaldare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando la BSA non è completamente sciolta. Vortice la miscela di acido oleico di nuovo per creare un'emulsione di goccioline fini e aggiungerlo immediatamente alla soluzione BSA utilizzando una pipetta di vetro.Mantenere la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a quando non rimane una soluzione giallastra chiara. Passare gli organoidi come descritto in precedenza e seminare le singole cellule derivate da organoidi in una piastra nera a fondo chiaro da 96 po '. Il sesto giorno di coltura su hSI-EM, sostituire il mezzo di coltura con hSI-EM contenente un millimolare dell'acido oleico e coniugato BSA.Incubare le cellule per 16-17 ore a 37 gradi Celsius in presenza o assenza di inibitore del DGAT1 micromolare 0,1. Successivamente, aspirare il mezzo senza disturbare le goccioline della matrice della membrana basale. Fissare gli organoidi aggiungendo 100 microlitri di formaldeide tamponata neutra al quattro per cento ai pozzi per 30 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere delicatamente e accuratamente la formaldeide con 150 microlitri di PBS per pozzo. Macchiare le cellule per goccioline lipidiche con 025 milligrammi per millilitro LD540 e DAPI in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi lavare accuratamente i pozzi con PBS.Per immagini panoramiche di interi organoidi utilizzare un soggettivo 40X adatto per l'imaging fluorescente confocale. Impostare il microscopio sull'immagine per DAPI e il colorante LD540 utilizzando le impostazioni di eccitazione ed emissione mostrate qui. Impostare le dimensioni del foro stenopeica su un'unità ariosa per una risoluzione sufficiente dell'asse Z.Per l'immagine della metà di un organoide sferico impostare una pila z su circa 85 micrometri. Utilizzando un sistema di elaborazione delle immagini appropriato, trasformate lo z-stack di ogni organoide in una proiezione massima facendo clic su Immagine, Pile, Progetto Z. Impostare la soglia della proiezione massima su un livello in cui non è visibile alcun segnale LD540 nel campione di controllo del veicolo BSA facendo clic su Immagine, Regola, Soglia.Usa queste impostazioni per sogliare ogni immagine. Quindi misurare l'area totale della fluorescenza per ogni proiezione massima utilizzando la funzione Analizza, Analizza particelle. Per una corretta analisi della formazione di goccioline lipidiche, gli organoidi non devono essere seminati troppo densamente prima della stimolazione con acido oleico e della successiva colorazione.Ciò è particolarmente importante per la lettura confocale e lettore di lastre poiché gli organoidi sovrapposti potrebbero interferire con la fluorescenza. Dopo la stimolazione con un millimolare di acido oleico durante la notte, la formazione di goccioline lipidiche può essere visualizzato con un microscopio a campo luminoso invertito. L'accumulo di goccioline lipidiche disperde la luce trasmessa, e quindi gli organoidi appaiono più scuri, mentre gli organoidi non stimolati hanno un aspetto traslucido.Una volta che gli organoidi stimolati dall'acido oleico sono fissi e macchiati, la formazione di goccioline lipidiche può essere visualizzato utilizzando un microscopio confocale. Poiché gli organoidi sono strutture 3D, un normale microscopio epifluorescente non è adatto a causa del segnale di fondo fuori fuoco, quindi una pila z confocale viene utilizzata per caratterizzare la LDF negli organoidi. La quantificazione dei campioni di microscopia confocale può anche essere eseguita utilizzando un lettore di lastre fluorescenti normalizzato al segnale fluorescente Hoechst.Il saggio del lettore di lastre indica una significativa diminuzione del segnale LD540 nelle cellule organoidi trattate con inibitore DGAT1 rispetto agli organoidi non trattati. La quantificazione della formazione di LD nelle singole cellule può essere ottenuta utilizzando un citometro a flusso. La strategia di gating qui mostrata è per gli organoidi intestinali umani dissociati.Istogrammi rappresentativi sia per l'SSC-A che per il segnale LD540 della popolazione finale di cellule vive mostrano che la formazione di goccioline lipidiche comporterà un aumento della SSC-A a causa della formazione di goccioline lipidiche intracellulari. Inoltre, le macchie di LD540 per i lipidi che vengono immagazzinate nelle goccioline lipidiche e il segnale aumenterà anche all'induzione della formazione di goccioline lipidiche. Come tale, la formazione di goccioline lipidiche è misurata come uno spostamento dell'intensità fluorescente media sia di SSC-A che di LD540.Le fasi più cruciali di questo protocollo sono la coltura di organoidi intestinali umani e la corretta ondulatazione dell'acido oleico in BSA. Per soddisfare più condizioni, questo test può essere analizzato utilizzando un lettore di lastre fluorescenti. Per correggere il numero organoide per pozzo, il segnale LD540 è stato normalizzato al segnale DAPI.Con questa tecnica, i ricercatori possono studiare la formazione di goccioline lipidiche nei sistemi organoidi e migliorare varie tecniche di analisi come la microscopia elettronica per convalidare i loro risultati.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Ricerca

Medicina

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Caratterizzazione dopo un metodo nuovo disaggregazione per Skin Micro-innesti Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin indotta Gonfiore intestinale organoidi: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per la valutazione della risposta farmacologica nella fibrosi cistica pazienti

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Elettrocardiografia simultanea registrazione e invasiva sangue pressione misura in ratti

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Indagare la rottura della barriera intestinale negli organiidi viventi

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...