Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Vi takker B. Spee for sjenerøst gir LD540. Dette arbeidet ble støttet av en Nederland organisasjon for Scientific Research stipend (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) til S.M.

All eksperimentering med menneskelig vev beskrevet her ble godkjent av etisk komité ved University Medical Center Utrecht (UMCU). Informert samtykke for vev innsamling, generering, lagring, og bruk av organoids ble innhentet fra pasienter ved Wilhelmina Children ' s Hospital (WKZ)-UMCU.
1. utarbeidelse av kultur Media
Merk: Denne protokollen bør utføres i et biosafety kabinett. Organoids skal håndteres i henhold til standard cellekultur retningsli...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Her gir vi en protokoll for å bestemme LD formasjon i menneskets intestinal organoids upon inkubasjons med oljesyre syre. Denne metoden er basert på LD-spesifikke fluorescerende fargestoff LD54018, som gjør det mulig for karakterisering og kvantifisering av det totale volumet av lipid dråper i en organoid kultur. Prosedyrene for å etablere og vedlikeholde menneskelige intestinal organoid kulturer har blitt publisert før13, og en visuell guide av denne protokollen er t...

Lipider er en avgjørende del av menneskets kosthold og spiller en viktig rolle i systemisk energilagring og metabolisme. Når svelget, er kosttilskudd lipider degradert til frie fettsyrer (FFAs) og monoglyserider (MGs) av bukspyttkjertelen lipaser. Disse underlag blir så tatt opp av enterocytes av tarm epitel, hvor de først re-forestret til diglyserider (DG) av monoglyceride acyltransferases (MGAT) enzymer og senere til triglyserider (TG) ved diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Til slutt, disse TGS er integrert i enten chylomicrons for eksport til lymfe systemet eller cytosolic lipid dråper (LDs) for intracellulære lagring2,3. Selv om chylomicrons er nødvendig for å distribuere kosttilskudd lipider til andre organer, er viktigheten av intracellulære fett lagring i LDs ikke helt klart. Imidlertid har LDs vist seg å utføre en regulerende funksjon i tarmen, da de langsomt slipper lipider inn i sirkulasjonen opp til 16 timer etter et måltid4. Videre har LDs blitt vist å beskytte mot giftige fatty acid konsentrasjoner, slik som i musen adipocytter under lipolytic forhold5.
DGAT1-proteinet er plassert på endoplasmatiske retikulum (ER)-membranen og spiller en avgjørende rolle i LD-formasjonen i tarm epitel. Homozygote mutasjoner i DGAT1 føre til tidlig utbruddet alvorlig diaré og/eller oppkast, hypoalbuminemia, og/eller (dødelig) protein-å miste intoleranse med intestinal svikt på fett inntak, illustrerer viktigheten av DGAT1 i lipid homeostase av den menneskelige intestinal epitel6,7,8,9,10. Siden forekomsten av DGAT1-mangel hos mennesker er sjelden, har tilgang til primære pasient-avledede celler vært knappe. Videre har den langsiktige kulturen i tarm epitelceller lenge vært begrenset til tumor-avledet cellelinjer som representerer normal fysiologi bare til en begrenset forlenge. Derfor har DGAT1-mediert ld-formasjon hovedsakelig blitt studert i fibroblaster eller animalsk avledede cellelinjer7,10,11,12. Slik, det ble nylig vist at DGAT1-mangelfull pasient-avledet fibroblaster akkumuleres mindre LDs sammenlignet med sunne kontroll celler etter stimulering med oljesyre acid (OA)8.
Tidligere ble protokoller etablert for å kultur epitel stamceller fra alle Gastrointestinal organ i form av tredimensjonale (3D) organoids13. Disse intestinal organoids kan oppbevares i kultur i lang tid13, og tillate funksjonell studie av pasient-og intestinal location-spesifikke epitel egenskaper14. De er genetisk og phenotypically stabile og kan oppbevares, slik at lang tids ekspansjon og biobanking13.
Vi har nylig demonstrert at LD-formasjonen lett kan måles i humant intestinal organoids i en LD-formasjon (LDF)-analysen6. Når de utsettes for OA for 16 h, organoids generere LDs å beskytte cellene fra lipid-indusert toksisitet. Når OA konsentrasjonen er for høy, cellene dør av ordtak-mediert apoptose6. LDF-analysen ble tidligere vist å være i stor grad avhengig av DGAT1 som indikert av organoids avledet fra DGAT1-mutant pasienter og ved bruk av DGAT1-spesifikke hemmere6.
For LDF analysen beskrevet i detalj her, 3D organoids er kultivert fra intestinal biopsier og er passert ukentlig ved avbrudd i enkeltceller som lett danner nye organoids. For å kjøre LDF analysen, er ~ 7 500 organoid-avledet enkeltceller belagt i hver brønn av en 24-brønn plate. Organoids dannes over flere dager, inkubert over natten med 1 mM OA og beiset med LD540, en fluorescerende celle gjennomtrengelig LD-spesifikk fargestoff som forenkler bildebehandling. LD-formasjonen kvantifisert deretter av konfokalmikroskopi mikroskopi, fluorescerende plate leser eller strømnings flowcytometri.
Ved å skalere denne LD-formasjonen til et 96-format, kan analysen også brukes til analyse av LD-formasjonen med høy gjennomstrømming til skjermen for nye legemidler som påvirker LD-formasjonen i menneskelige tarm organoid kulturer, eller for å studere (menneskelige genetiske) lidelser som påvirker LD metabolisme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Fôr lipider er tatt opp som frie fettsyrer (FAs) av tarm epitel. Disse FAs er intracellulært omgjort til triglyserider (TG) molekyler, før de er pakket inn i chylomicrons for transport til lymfe eller inn cytosolic lipid dråper (LDs) for intracellulære lagring. Et avgjørende skritt for dannelsen av LDs er katalysator for diacylglycerol acyltransferases (DGAT) i det siste trinnet av TG-syntese. LDs er viktig å buffer giftige lipid arter og regulere cellulær metabolisme i ulike celletyper. Siden det menneskelige tarm epitel er regelmessig konfrontert med høye konsentrasjoner av lipider, er LD formasjon av stor betydning for å regulere homeostase. Her beskriver vi en enkel analyse for karakterisering og kvantifisering av LD-formasjonen (LDF) ved stimulering med de vanligste umettede fettsyrer, oljesyre syre, i Human intestinal organoids. LDF-analysen er basert på det LD-spesifikke fluorescerende fargestoffet LD540, som gjør det mulig for kvantifisering av LDs ved konfokalmikroskopi mikroskopi, fluorescerende plate leser eller flyt flowcytometri. LDF-analysen kan brukes til å karakterisere LD-formasjonen i humane tarm epitelceller, eller til å studere menneskelige (genetiske) lidelser som påvirker LD-metabolismen, for eksempel DGAT1-mangel. Videre kan denne analysen også brukes i en høy gjennomstrømming rørledning for å teste romanen terapeutiske forbindelser, som gjenoppretter defekter i LD formasjon i intestinal eller andre typer organoids.

For riktig analyse av LD-formasjonen bør ikke organoids være for tett før stimulering med OA og påfølgende farging. Dette er spesielt av betydning for konfokalmikroskopi og plate leser avlesning, siden overlappende organoids kan forstyrre fluorescens. Et eksempel på riktig organoid seeding tetthet (figur 1A) og en kultur med overlappende organoids vises (figur 1B). For å minimere variasjon...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Denne protokollen beskriver en analyse for karakterisering av lipid dråpe (LD) formasjon i menneskets intestinal organoids upon stimulering med fettsyrer. Vi diskuterer hvordan denne analysen brukes til kvantifisering av LD-formasjonen, og hvordan den kan brukes til screening med høy gjennomstrømming for legemidler som påvirker LD-formasjonen.

En fluorescens-basert analyse for karakterisering og kvantifisering av lipid dråpe dannelse i Human intestinal Organoids

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Denne protokollen beskriver noen metoder for å kvantifisere lipiddråpedannelse i menneskelige tarmorganoider. Den kan brukes som en høy gjennomstrømningsscreeningplattform for å teste for legemidler som modulerer lipiddråpedannelse. Metoden vi beskriver er basert på en lipiddråpespesifikt fargestoff og biopsiavledede tarmorganoider.Det gir dermed en stabil, nøyaktig og fysiologisk relevant modell for lipiddråpedannelse. Denne protokollen kan brukes til å screene for pasientspesifikke nye legemiddelkandidater som modulerer lipiddråper dannelse, for eksempel hos DGAT1-mangelfulle pasienter. Denne lipid dråpeformasjonsanalysen kan også brukes på andre typer organoide kulturer for å studere lipidmetabolisme i andre celletyper.Analysen er i betydelig grad avhengig av tettheten av organoidkulturen. Prøv å sikre en konsekvent organoid tetthet på tvers av prøver og eksperimenter. Visuell demonstrasjon av denne analysen er kritisk fordi det er viktig å vise hvordan organoiden skal dyrkes og hvordan de skal håndteres for å sikre riktig analyse av lipiddråpedannelse.Etter å ha forberedt organoider, aspirer forsiktig kulturmediet uten å forstyrre dråpene i kjellermembranmatrisen. Tilsett 500 mikroliter med kaldt basal medium til den første brønnen av organoider. Bruk en P1000 pipette, forsiktig pipette opp og ned for å forstyrre kjelleren membran matrise dråper med organoider.Gjenta disse prosedyrene med samme medium i neste brønn som nødvendig, men ikke høst mer enn to brønner per 500 mikroliter basal medium. Samle organoider i en lavbindende 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, og spinne dem ned i en mini-bordplate sentrifuge i 15 til 20 sekunder. Tilsett 400 mikroliter trypsin til spunnet ned organoider.Inkuber i et vannbad på 37 grader Celsius i fem minutter. Deretter bruker du en P200-pipette til å forsiktig pipettere fjæringen opp og ned for å forstyrre de gjenværende mengdecellene. Inkuber i et vannbad på 37 grader Celsius i fem minutter.Når bare enkeltceller gjenstår, legg til en milliliter basal medium, og spinn ned cellene i en mini-bordplate sentrifuge i 15 til 20 sekunder. Aspirer det overnaturlige helt. Bruk en P200-pipette til å suspendere enkeltcellene på nytt i 200 mikroliter frisk hSI-EM, og legg til ytterligere 800 mikroliter hSI-EM.Tell deretter antall celler i suspensjon og beregn volumet av celler som trengs for den endelige celletettheten. Ta ut riktig volum av suspensjon og justere tettheten til 750 celler per mikroliter. Tilsett kjellermembranmatrise til cellesuspensjonen i et forhold på to til en.Rør forsiktig suspensjonen for å blande vær forsiktig for å unngå å lage bobler. I en forvarmet kulturplate frøs du ut tre 10 mikroliterdråper per brønn hvis platen har 24 brønner eller en fem mikroliterdråpe per brønn hvis platen har 96 brønner. Legg platen i en inkubator ved 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid i 10 til 15 minutter for å stivne dråpene.I mellomtiden, pre-warm et passende volum av hSI-EM + Y i et vannbad på 37 grader Celsius. Etter dette, legg forsiktig til den forhåndsoppvarmede hSI-EM + Y til hver brønn av platen. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med fem prosent karbondioksid.Etter to til tre dager erstatter du mediet med hSI-EM og må oppdatere det to til tre ganger i uken. Først veie 0,2 gram flytende oljesyre ved romtemperatur. Tilsett 1,5 milliliter av kultur-grade steril PBS og varme blandingen til 70 grader Celsius i en time, og sørg for å virvle midlertidig.Deretter veier du 5,89 gram fettsyrefri BSA og oppløser den i 33,9 milliliter PBS. Varm blandingen i et vannbad ved 37 grader Celsius til BSA er fullstendig oppløst. Vortex oljesyreblandingen igjen for å lage en emulsjon av fine dråper og legg den umiddelbart til BSA-løsningen ved hjelp av en glasspipette.Hold blandingen på 37 grader Celsius i 30 minutter til en klar gulaktig løsning forblir. Pass organoidene som tidligere beskrevet og frø ut organoid-avledede enkeltceller i en svart klar bunn 96-brønnplate. På dag seks av kultering på hSI-EM, erstatte kulturmediet med hSI-EM som inneholder en millimolar av oljesyre og BSA konjugat.Inkuber cellene i 16 til 17 timer ved 37 grader Celsius i nærvær eller fravær av 0,1 mikromolar DGAT1-hemmer. Etter dette, aspirere mediet uten å forstyrre kjelleren membran matrise dråper. Fest organoidene ved å tilsette 100 mikroliter med fire prosent nøytral bufferet formaldehyd til brønnene i 30 minutter ved romtemperatur.Fjern formaldehydet forsiktig og vask forsiktig cellene med 150 mikroliter PBS per brønn. Beis cellene for lipiddråper med 025 milligram per milliliter LD540 og DAPI i PBS i 15 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask deretter brønnene nøye med PBS.For oversiktsbilder av hele organoider bruk en 40X subjektiv egnet for konfokal fluorescerende bildebehandling. Sett mikroskopet til bildet for DAPI og LD540-fargestoffet ved hjelp av eksitasjons- og utslippsinnstillingene som vises her. Sett pinholestørrelsen til en luftete enhet for tilstrekkelig z-akseoppløsning.For å bilde halvparten av en sfærisk organoid sette en z-stabel til ca 85 mikrometer. Ved hjelp av et passende bildebehandlingssystem kan du forvandle z-stakken for hver organoid til en maksimal projeksjon ved å klikke Bilde, Stabler, Z Project. Sett terskelen for den maksimale projeksjonen til et nivå der det ikke er noe LD540-signal synlig i BSA-kjøretøykontrollprøven ved å klikke Bilde, Juster, Terskel.Bruk disse innstillingene til å terskele hvert bilde. Mål deretter det totale fluorescensområdet for hver maksimale projeksjon ved hjelp av funksjonen Analyser, analyser partikler. For riktig analyse av lipiddråpedannelse, bør organoidene ikke seedes for tett før stimulering med oljesyre og påfølgende farging.Dette er spesielt viktig for den konfokale og plateleseravlesningen, siden overlappende organoider kan forstyrre fluorescensen. Etter stimulering med en millimolar oljesyre over natten, kan lipiddråpedannelse visualiseres med et omvendt, lystfeltmikroskop. Akkumuleringen av lipiddråper sprer overført lys, og derfor ser organoidene mørkere ut, mens ikke-stimulerte organoider har et gjennomsiktig utseende.Når de oljesyrestimulerte organoidene er faste og farget, kan lipiddråpedannelsen visualiseres ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Siden organoidene er 3D-strukturer, er et vanlig epifluorescerende mikroskop ikke egnet på grunn av bakgrunnssignalet utenfor fokus, så en konfokal z-stabel brukes til å karakterisere LDF i organoider. Kvantifisering av de konfokale mikroskopiprøvene kan også utføres ved hjelp av en fluorescerende plateleser normalisert til det fluorescerende Hoechst-signalet.Plateleseranalysen indikerer en signifikant reduksjon i LD540-signalet i organoidceller behandlet med DGAT1-hemmer sammenlignet med ubehandlede organoider. Kvantifisering av LD dannelse i enkelte celler kan oppnås ved hjelp av en strømningscytometer. Gating strategien vist her er for dissosierte menneskelige intestinal organoider.Representative histogrammer for både SSC-A og LD540-signalet fra den endelige levende cellepopulasjonen viser at lipiddråpedannelse vil resultere i en økning i SSC-A på grunn av dannelsen av intracellulære lipiddråper. I tillegg vil LD540 flekker for lipider som er lagret i lipiddråpene, og signalet vil også øke ved induksjon av lipiddråpedannelse. Som sådan måles lipiddråpedannelse som et skifte i gjennomsnittlig fluorescerende intensitet av både SSC-A og LD540.De viktigste trinnene i denne protokollen er kulturen av menneskelige tarmorganoider og riktig korrugering av oljesyre til BSA. For å imøtekomme flere forhold, kan denne analysen analyseres ved hjelp av en fluorescerende plateleser. For å korrigere for organoidnummeret per brønn, ble LD540-signalet normalisert til DAPI-signalet.Med denne teknikken kan forskere studere lipiddråpedannelse i organoidsystemer, og forbedre ulike analyseteknikker som elektronmikroskopi for å validere sine funn.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation analysen fra Menneskelig Breast Cancer Vev og cellelinjer

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utnyttelse i Soft Agar Colony Forming analyse for å identifisere hemmere av tumorgenisitet i brystkreftceller

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Etablering og karakterisering av UTI og CAUTI i en musemodell

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Karakterisering etter en ny Disaggregering metode for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk endotelcelle Tube Dannelse analyse: Sammenligning ekstracellulær matriks og Growth Factor Redusert ekstracellulær matriks

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-mediert tomografi av kvantifisering av Macrophage-relaterte Murine intestinale betennelsen

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

En kinetisk fluorescens-baserte Ca2 + mobilisering analysen identifisere G Protein-kombinert reseptor agonister antagonister og Allosteric modulatorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Samtidige Electrocardiography opptak og invasiv blod trykk måling i rotter

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Undersøke intestinal barriere sammenbrudd i levende organoider

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...