Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Мы благодарим B. Spee за щедрое предоставление LD540. Эта работа была поддержана Нидерландской организацией по научным исследованиям гранта (НВО-ЗонМ; VIDI 016.146.353) до S.M.

Все эксперименты с использованием человеческих тканей, описанных в данном случае, были одобрены комитетом по этике в Университетском медицинском центре Утрехта (UMCU). Информированное согласие на сбор тканей, генерацию, хранение и использование органоидов было получено от пациентов Вил...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Здесь мы предоставляем протокол для определения образования ЛД в кишечных органоидах человека при инкубации олеиновой кислотой. Этот метод основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD54018, который позволяет охарактеризовать и количественно определить общий объ?...

Липиды являются важнейшим компонентом рациона человека и играют важную роль в системном хранении энергии и обмене веществ. При попавании, диетические липиды деградируют в свободные жирные кислоты (FFAs) и моноглицериды (MGs) поджелудочной липасы. Эти субстраты затем принимаются энтероцитов кишечного эпителия, где они впервые повторно эстерикрины диглицеридов (DG) моноглицерид acyltransferases (MGAT) ферментов, а затем триглицеридов (TG) по диацилглицерола ацилтрансфераза 1 (DGAT1)1. Наконец, эти TGs интегрированы в либо хиломикроны для экспорта в лимфодренаж или цитосолико липидных капель (LDs) для внутриклеточного хранения2,3. Хотя хиломикроны необходимы для распространения диетических липидов в другие органы, важность внутриклеточного хранения жира в ЛД не совсем ясно. Тем не менее, LDs было показано, чтобы выполнять регулятивные функции в кишечнике, так как они медленно высвобождают липиды в циркуляцию до 16 ч после еды4. Кроме того, Было показано, что ЛД защищают от токсичных концентраций жирных кислот, таких как адипоциты мыши во время липолицовых состояний5.
Белок DGAT1 расположен на эндоплазмической мембране ретикулума (ER) и играет решающую роль в формировании ЛД в эпителии кишечника. Гомозиготные мутации в DGAT1 приводят к раннему началу тяжелой диареи и/или рвоты, гипоальбуминемии и/или (смертельной) белково-терпящей энтеропатии с кишечной недостаточностью при жировом наедевидеи, иллюстрируя важность DGAT1 в липидном гомеостазах человека кишечный эпителий6,7,8,9,10. Поскольку возникновение дефицита DGAT1 у людей встречается редко, доступ к первичным клеткам, полученным пациентом, был скудным. Кроме того, долгосрочная культура кишечных эпителиальных клеток уже давно ограничивается опухолевыми клеточными линиями, которые представляют нормальную физиологию только в ограниченном плане. Таким образом, DGAT1-опосредованного образования ЛД в основном были изучены в фибробластов или животных полученных клеточных линий7,10,11,12. Таким образом, недавно было показано, что DGAT1-дефицитных пациента полученных фибробластов накапливаются меньше LDs по сравнению со здоровыми контрольными клетками после стимуляции с олеиновой кислотой (ОА)8.
Ранее были установлены протоколы для культуры эпителиальных стволовых клеток из любого желудочно-кишечного органа в виде трехмерных (3D) органоидов13. Эти кишечные органоиды могут храниться в культуре в течение длительного периода времени13, и позволяют функциональное исследование пациента и кишечного расположения конкретных эпителиальных характеристик14. Они генетически и фенотипически стабильны и могут храниться, что позволяет долгосрочное расширение и биобанкинг13.
Недавно мы показали, что образование ЛД может быть легко измерено в кишечных органоидов человека в формировании ЛД (LDF) анализ6. При воздействии ОА в течение 16 ч органоиды генерируют ЛД для защиты клеток от липидной токсичности. Когда концентрации ОА слишком высоки, клетки умирают от каспасопо-опосредованного апоптоза6. Ранее было показано, что ассси LDF в значительной степени зависит от DGAT1, о чем свидетельствуют органоиды, полученные от пациентов DGAT1-мутантов и использование ингибиторов DGAT1-специфических6.
Для анализа LDF, подробно описанного здесь, 3D органоиды культивируются из кишечной биопсии и проходят еженедельно путем нарушения в одиночных клетках, которые легко образуют новые органоиды. Для выполнения dF-ассссса, 7500 одиночных клеток, полученных от органоидов, покрываются в каждом колодце 24-колодца пластины. Органоиды образуются в течение нескольких дней, инкубируется на ночь с 1 мМ ОА и окрашенных LD540, флуоресцентные клетки проницаемой LD-специфический краситель, который облегчает визуализацию. Формирование ЛД затем количественно конфокальной микроскопии, флуоресцентные пластины читателя, или поток цитометрии.
Путем масштабировать это испытание образования LD к формату 96-наилучшим образом, анализ можно также использовать для высокопроемного анализа образования LD для того чтобы экранировать для новых снадобиь которые влияют на образование LD в людских кишечных органоидных культурах, или изучить (людской генетические) разлады которые влияют на Метаболизм ЛД.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Диетические липиды принимаются в качестве свободных жирных кислот (ФА) кишечным эпителием. Эти FAs внутриклеточные преобразуются в молекулы триглицеридов (TG), прежде чем они упакованы в chylomicrons для транспортировки в лимфу или в цитосолитовые липидные капли (ЛД) для внутриклеточного хранения. Решающим шагом для формирования ЛД является каталитическая активность диацилглицерола ацилтрансферазы (DGAT) в заключительном этапе синтеза TG. LDs важны для буфера токсичных видов липидов и регулировать клеточный метаболизм в различных типах клеток. Так как человеческий кишечный эпителий регулярно сталкивается с высокой концентрацией липидов, образование ЛД имеет большое значение для регулирования гомеостаза. Здесь мы описываем простой анализ для характеристики и количественной оценки образования ЛД (ЛДФ) при стимуляции с наиболее распространенными ненасыщенными жирными кислотами, олеиновой кислотой, в кишечных органоидах человека. Анализ LDF основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD540, который позволяет количественно оценивать LDs конфокальной микроскопией, флуоресцентным считыванием пластин, или цитометрией потока. Анализ LDF может быть использован для характеристики образования ЛД в кишечных эпителиальных клетках человека, или для изучения человеческих (генетических) расстройств, которые влияют на метаболизм ЛД, таких как дефицит DGAT1. Кроме того, этот анализ может также быть использован в высокой пропускной связи для тестирования новых терапевтических соединений, которые восстанавливают дефекты в образовании ЛД в кишечнике или других типах органоидов.

Для правильного анализа образования ЛД органоиды не должны быть засеяны слишком плотно до стимуляции с ОА и последующего окрашивания. Это особенно важно для считывателя конфокальных и пластин, так как перекрывающиеся органоиды могут мешать флуоресценции. Показан пр?...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Этот протокол описывает анализ для характеристики липидных капель (LD) формирования в человеческих кишечных органоидов при стимуляции жирными кислотами. Мы обсуждаем, как этот анализ используется для количественной оценки образования ЛД, и как он может быть использован для высокой пропускной связи скрининга на наркотики, которые влияют на образование ЛД.

Флуоресценция основе анализа для характеристики и количественной оценки образования липидных капель в кишечных органоидов человека

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Этот протокол описывает некоторые методы количественной оценки образования липидных капель в кишечных органоидах человека. Он может быть использован в качестве высокой пропускной способности скрининговой платформы для тестирования на препараты, которые модулируют образование липидных капель. Метод, который мы описываем, основан на липидном капельном красителе и кишечных органоидах, полученных биопсией.Таким образом, она обеспечивает стабильную, точную и физиологически-релевантную модель формирования липидных капель. Этот протокол может быть использован для проверки для конкретных пациентов новых кандидатов наркотиков, которые модулируют образование липидных капель, например, у пациентов с дефицитом DGAT1. Этот анализ образования капель липидов также может быть применен к другим типам органоидных культур для изучения метаболизма липидов в других типах клеток.Анализ в значительной степени зависит от плотности органоидной культуры. Старайтесь обеспечить последовательную плотность органоидов в образцах и экспериментах. Визуальная демонстрация этого анализа имеет решающее значение, потому что важно показать, как органоид должен быть культурным и как они должны быть обработаны для обеспечения надлежащего анализа формирования липидных капель.После подготовки органоидов, тщательно аспирировать культурную среду, не нарушая капель мембранной матрицы подвала. Добавьте 500 микролитров холодной базальной среды к первой колодец органоидов. Используя P1000 пипетку, осторожно пипетки вверх и вниз, чтобы нарушить мембрану подвала матричных капель с органоидами.Повторите эту процедуру с той же среде в следующем также, как требуется, но не собирают более двух скважин на 500 микролитров базальной среды. Соберите органоиды в низкообязательную микроцентрифугную трубку с низким содержанием 1,5 миллилитров и вращайте их в центрифуге с мини-столешницей в течение 15-20 секунд. Добавьте 400 микролитров трипсина в закрученные органоиды.Инкубировать в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Далее используйте пипетки P200, чтобы аккуратно пипетки подвески вверх и вниз, чтобы нарушить оставшиеся агрегаты клеток. Инкубировать в водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.Когда останутся только одиночные клетки, добавьте один миллилитр базальной среды и вращайте клетки в центрифуге с мини-столешницей в течение 15-20 секунд. Аспирировать супернатант полностью. Используйте пипетки P200 для повторной приостановки одиночных ячеек в 200 микролитров свежих hSI-EM и добавления дополнительных 800 микролитров hSI-EM.Затем подсчитайте количество ячеек в суспензии и рассчитайте объем ячеек, необходимых для окончательной плотности клеток. Вынюйте соответствующий объем подвески и отрегулируйте плотность до 750 клеток на микролитер. Добавьте мембранную матрицу к клеточной подвеске в соотношении два к одному.Аккуратно пипетка подвески смешать быть осторожным, чтобы избежать создания пузырьков. В предварительно разогретой пластине культуры, семена из трех 10-микролитровых капель на скважину, если пластина имеет 24 скважин или один пятиминер капли на скважину, если пластина имеет 96 скважин. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентным углекислым газом в течение 10-15 минут, чтобы затвердеть капли.Между тем, предварительно разогреть соответствующий объем hSI-EM-Y в водяной бане при 37 градусах по Цельсию. После этого аккуратно добавьте предварительно разогретый hSI-EM-Y к каждому колодец пластины. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с пяти процентов углекислого газа.Через два-три дня замените носитель на hSI-EM и не забудьте обновить ее два-три раза в неделю. Во-первых, весят 0,2 грамма жидкой олеиновой кислоты при комнатной температуре. Добавьте 1,5 миллилитров стерильного PBS культурного класса и нагревайте смесь до 70 градусов по Цельсию в течение одного часа, убедившись, что вихрь периодически.Затем взвесьте 5,89 грамма без жирных кислот BSA и растворите его в 33,9 миллилитров PBS. Разогреть смесь на водяной бане при 37 градусах по Цельсию до полного растворения BSA. Vortex олеиновой кислоты смесь снова создать эмульсию мелких капель и сразу же добавить его в раствор BSA с помощью стеклянной пипетки.Держите смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, пока не останется ясный желтоватый раствор. Прохождение органоидов, как описано ранее, и семян из органоидных полученных одиночных клеток в черный ясно-дно 96-хорошо пластины. На шестой день культивирования на hSI-EM, заменить культурную среду с hSI-EM, содержащий один миллимолар олеиновой кислоты и BSA конъюгации.Инкубировать клетки в течение 16 до 17 часов при 37 градусах Цельсия при наличии или отсутствии ингибитора 0,1 микромолара DGAT1. После этого, аспирировать среды, не нарушая мембраны мембраны матричных капель. Зафиксировать органоиды, добавив 100 микролитров четырехпроцентного нейтрального буферного формальдегида в скважины в течение 30 минут при комнатной температуре.Снимите формальдегид осторожно и тщательно промыть клетки с 150 микролитров PBS на колодец. Пятно клеток для липидных капель с 025 миллиграммов на миллилитр LD540 и DAPI в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Затем тщательно промыть колодцы с PBS.Для обзорных изображений целых органоидов используйте 40X субъективный подходит для конфокальных флуоресцентных изображений. Установите микроскоп для изображения DAPI и красителя LD540 с использованием параметров возбуждения и выбросов, показанных здесь. Установите размер пинхол до одного воздушного блока для достаточного разрешения z-оси.Для изображения половины сферического органоида установите z-стек примерно до 85 микрометров. Используя соответствующую систему обработки изображений, преобразуйте z-стек каждого органоида в максимальную проекцию, нажав на изображение, стеки, проект. Установите порог максимальной проекции до уровня, при котором в образце управления транспортным средством BSA нет сигнала LD540, нажав на изображение, отрегулируйте, порог.Используйте эти настройки для порога каждого изображения. Затем измерьте общую площадь флуоресценции для каждой максимальной проекции с помощью функции Анализируйте, анализируйте частицы. Для правильного анализа образования липидных капель органоиды не должны быть посеяны слишком плотно до стимуляции олеиновой кислотой и последующим окрашиванием.Это особенно важно для конфокального и пластины читателя считывания, поскольку перекрывающиеся органоиды могут вмешиваться в флуоресценцию. После стимуляции с одним миллимоляном олеиновой кислоты на ночь образование липидных капель можно визуализировать с помощью перевернутого ярко-полевого микроскопа. Накопление липидных капель рассеивает передаваемый свет, и поэтому органоиды кажутся темнее, в то время как не стимулированные органоиды имеют полупрозрачный вид.После того, как олеиновой кислоты стимулировали органоиды фиксируются и окрашены, липидные капли формирования могут быть визуализированы с помощью конфокального микроскопа. Поскольку органоиды являются 3D структурами, обычный эпифлуоресцентный микроскоп не подходит из-за внефокусного фонового сигнала, поэтому конфокальный z-стек используется для характеристики LDF в органоидах. Количественная оценка образцов конфокальные микроскопии также может быть выполнена с помощью флуоресцентного считывателя пластин, нормализуемого к флуоресцентного сигнала Hoechst.Анализ считывателя пластин указывает на значительное снижение сигнала LD540 в органоидных клетках, обработанных ингибитором DGAT1 по сравнению с необработанными органоидами. Количественная оценка образования LD в отдельных клетках может быть достигнута с помощью цитометра потока. Стратегия gating показанная здесь для dissociated людских кишечных organoids.Репрезентативные гистограммы как для SSC-A, так и для сигнала LD540 окончательной популяции живых клеток показывают, что образование липидных капель приведет к увеличению SSC-A из-за образования внутриклеточных липидных капель. Кроме того, LD540 пятна для липидов, которые хранятся в липидных капель, и сигнал будет также увеличиваться при индукции образования липидных капель. Таким образом, образование липидных капель измеряется как сдвиг в среднем флуоресцентной интенсивности как SSC-A, так и LD540.Наиболее важными шагами этого протокола являются культура кишечных органоидов человека и надлежащее гофрирование олеиновой кислоты к BSA. Чтобы приспособить больше условий, этот анализ может быть проанализирован с помощью флуоресцентного считывателя пластин. Чтобы исправить число органоидов на колодец, сигнал LD540 был нормализован к сигналу DAPI.С помощью этого метода, исследователи могут изучать образование липидных капель в органоидных системах, и улучшить различные методы анализа, такие как электронная микроскопия для проверки своих выводов.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Формирование анализа из рака молочной железы человека тканях и клеточных линий

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Создание и характеристика ИМП и CAUTI в мышиной модели

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Стратегическая эндотелиальных клеток Tube Формирование анализа: Сравнение внеклеточного матрикса и фактор роста Снижение внеклеточного матрикса

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Флуоресценции опосредованной томография для выявления и количественной оценки мышиных кишечного воспаления Макрофаг связанных

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Кинетическая на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Запись одновременно электрокардиография и инвазивных крови давления измерения в крыс

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Исследование кишечного барьера Разбивка в живых органоидов

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...