Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Agradecemos a B. Spee por proporcionar generosamente LD540. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.

Toda la experimentación con los tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por el comité ético del University Medical Center Utrecht (UMCU). Se obtuvo un consentimiento informado para la recolección, generación, almacenamiento y uso de los organoides de los pacientes en el Wilhelmina Children's Hospital (WKZ)-UMCU.
1. Preparación de medios de comunicación culturales
NOTA: Este protocolo debe realizarse dentro de un gabinete de bio...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Aquí, proporcionamos un protocolo para determinar la formación de LD en organoides intestinales humanos tras la incubación con ácido oleico. Este método se basa en el tinte fluorescente específico ld 54018,que permite la caracterización y cuantificación del volumen total de gotas lipídicas dentro de un cultivo organoide. Los procedimientos para establecer y mantener los cultivos organoides intestinales humanos se han publicado antes de13, y una guía visual de este...

Los lípidos son un componente crucial de la dieta humana y juegan un papel importante en el almacenamiento de energía sistémica y el metabolismo. Cuando se ingenian, los lípidos dietéticos se degradan en ácidos grasos libres (FFA) y monoglicéridos (GM) por lipasas pancreáticas. Estos sustratos son entonces tomados por los enterocitos del epitelio intestinal, donde primero son reesterificados a diglicéridos (DG) por enzimas aciltransferasas monoglicéridos (MGAT) y posteriormente a triglicéridos (TG) por diacilglicerol acitransferasa 1 (DGAT1)1. Por último, estos TG s están integrados en quilomicrones para su exportación al sistema linfático o gotas lipídicas citosólicas (LD) para el almacenamiento intracelular2,3. Aunque se necesitan quilomicrones para distribuir lípidos dietéticos a otros órganos, la importancia del almacenamiento de grasa intracelular en los D No está completamente clara. Sin embargo, se ha demostrado que los DN realizan una función reguladora en el intestino, ya que liberan lentamente lípidos en la circulación hasta 16 h después de una comida4. Además, se ha demostrado que los LU protegen contra las concentraciones de ácidos grasos tóxicos, como en los adipocitos de ratón durante condiciones lililíticas5.
La proteína DGAT1 se encuentra en la membrana del retículo endoplasmático (ER) y desempeña un papel crucial en la formación de LD en el epitelio intestinal. Las mutaciones homocigotas en DGAT1 conducen a diarrea y/o vómitos graves de inicio temprano, hipoalbuminemia y/o enteropatía (fatal) que pierde proteínas con insuficiencia intestinal al tener grasa, lo que ilustra la importancia de DGAT1 en la homeostasis lipídica del ser humano epitelio intestinal6,7,8,9,10. Dado que la aparición de deficiencia de DGAT1 en humanos es poco frecuente, el acceso a las células primarias derivadas del paciente ha sido escaso. Además, el cultivo a largo plazo de las células epiteliales intestinales se ha restringido durante mucho tiempo a las líneas celulares derivadas de tumores que representan la fisiología normal sólo a una extensión limitada. Por lo tanto, la formación de LD mediada por DGAT1 se ha estudiado principalmente en fibroblastos o líneas celulares de origen animal7,10,11,12. Como tal, recientemente se demostró que los fibroblastos derivados del paciente con deficiencia de DGAT1 acumulan menos LDs en comparación con las células de control sanas después de la estimulación con ácido oleico (OA)8.
Anteriormente, se establecieron protocolos para cultivar células madre epiteliales de cualquier órgano gastrointestinal en forma de organoides tridimensionales (3D)13. Estos organoides intestinales se pueden mantener en cultivo durante un largo período de tiempo13,y permiten el estudio funcional de las características epiteliales específicas del paciente e intestinal14. Son genética y fenotípicamente estables y pueden almacenarse, permitiendo la expansión a largo plazo y la biobanca13.
Recientemente demostramos que la formación de LD se puede medir fácilmente en organoides intestinales humanos en un ensayo de formación de LD (LDF)6. Cuando se exponen a OA durante 16 h, los organoides generan LDs para proteger las células de la toxicidad inducida por lípidos. Cuando las concentraciones de OA son demasiado altas, las células mueren por apoptosis mediada por caspasa6. Anteriormente se demostró que el ensayo LDF dependía en gran medida de DGAT1, como indican los organoides derivados de pacientes con mutantes DGAT1 y el uso de inhibidores específicos de DGAT16.
Para el ensayo de LDF descrito en detalle aquí, los organoides 3D se cultivan a partir de biopsias intestinales y se reperduen semanalmente por la interrupción en células individuales que forman fácilmente nuevos organoides. Para ejecutar el ensayo de LDF, se celen células individuales derivadas de organoides de 7.500 euros en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Los organoides se forman durante varios días, se incuban durante la noche con 1 mM de OA y se tiñen con LD540, un tinte específico para LD permeable a las células fluorescentes que facilita la toma de imágenes. La formación de LD se cuantifica entonces mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo.
Al escalar este ensayo de formación de LD a un formato de 96 pozos, el ensayo también se puede utilizar para el análisis de alto rendimiento de la formación de LD para detectar nuevos fármacos que afectan a la formación de LD en cultivos organoides intestinales humanos, o para estudiar trastornos (genéticos humanos) que afectan Metabolismo de la LD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Los lípidos dietéticos son tomados como ácidos grasos libres (FAs) por el epitelio intestinal. Estos FA se convierten intracelularmente en moléculas de triglicéridos (TG), antes de que se envasen en quilomicrones para su transporte a la linfa o en gotas de lípidos citosólicos (LD) para el almacenamiento intracelular. Un paso crucial para la formación de LOS LU es la actividad catalítica de las aciltransferasas diacilglicerol (DGAT) en el paso final de la síntesis de TG. Los D.M. son importantes para amortiguar las especies de lípidos tóxicos y regular el metabolismo celular en diferentes tipos de células. Dado que el epitelio intestinal humano se enfrenta regularmente con altas concentraciones de lípidos, la formación de LD es de gran importancia para regular la homeostasis. Aquí describimos un simple ensayo para la caracterización y cuantificación de la formación de LD (LDF) sobre la estimulación con el ácido graso insaturado más común, el ácido oleico, en los organoides intestinales humanos. El ensayo LDF se basa en el tinte fluorescente LD540 específico de LD, que permite cuantificar los D mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo. El ensayo LDF se puede utilizar para caracterizar la formación de LD en células epiteliales intestinales humanas, o para estudiar trastornos humanos (genéticos) que afectan el metabolismo de la LD, como la deficiencia de DGAT1. Además, este ensayo también se puede utilizar en una tubería de alto rendimiento para probar nuevos compuestos terapéuticos, que restauran defectos en la formación de LD en los órganooides intestinales u otros tipos.

Para un análisis adecuado de la formación de LD, los organoides no deben ser sembrados demasiado densamente antes de la estimulación con OA y posterior tinción. Esto es especialmente importante para la lectura confocal y lector de placas, ya que los organoides superpuestos podrían interferir con la fluorescencia. Se muestra un ejemplo de densidad de semilla de organoides adecuada(Figura 1A) y un cultivo con organoides superpuestos (<stro...

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A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Este protocolo describe algunos métodos para cuantificar la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos. Se puede utilizar como una plataforma de cribado de alto rendimiento para probar fármacos que modulan la formación de gotas de lípidos. El método que describimos se basa en un tinte específico para gotas de lípidos y organoides intestinales derivados de biopsias.Por lo tanto, proporciona un modelo estable, preciso y fisiológicamente relevante para la formación de gotas de lípidos. Este protocolo se puede utilizar para detectar nuevos candidatos a fármacos específicos del paciente que modulan la formación de gotas de lípidos, por ejemplo, en pacientes con deficiencia de DGAT1. Este ensayo de formación de gotas lipídicas también se puede aplicar a otros tipos de cultivos organoides para estudiar el metabolismo de los lípidos en otros tipos de células.El ensayo depende en gran medida de la densidad del cultivo organoide. Trate de asegurar una densidad organoidea consistente entre muestras y experimentos. La demostración visual de este ensayo es crítica porque es importante mostrar cómo se debe cultivar el organoide y cómo deben tratarse para asegurar un análisis adecuado de la formación de gotas lipídicas.Después de preparar los organoides, aspirar cuidadosamente el medio de cultivo sin alterar las gotas de la matriz de membrana del sótano. Añadir 500 microlitros de medio basal frío al primer pozo de organoides. Con una pipeta P1000, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para interrumpir las gotas de matriz de membrana del sótano con organoides.Repita estos procedimientos con el mismo medio en el siguiente, así como sea necesario, pero no cosechar más de dos pozos por cada 500 microlitros de medio basal. Recoger los organoides en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión, y girarlos hacia abajo en una centrífuga de mini-mesa durante 15 a 20 segundos. Añadir 400 microlitros de trippsina a los organoides hilados.Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, utilice una pipeta P200 para pipetear suavemente la suspensión hacia arriba y hacia abajo para interrumpir los agregados restantes de las células. Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos.Cuando sólo quedan células individuales, agregue un mililitro de medio basal y gire hacia abajo las células en una centrífuga de mini-tabletop durante 15 a 20 segundos. Aspirar el sobrenadante por completo. Utilice una pipeta P200 para volver a suspender las células individuales en 200 microlitros de hSI-EM fresco, y agregue 800 microlitros adicionales de hSI-EM.Luego cuente el número de celdas en suspensión y calcule el volumen de células necesarias para la densidad final de la celda. Saque el volumen adecuado de suspensión y ajuste la densidad a 750 células por microlitro. Agregue la matriz de membrana del sótano a la suspensión celular en una proporción de dos a uno.Pipetee suavemente la suspensión para mezclar teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas. En una placa de cultivo precalentada, sembra tres gotas de 10 microlitros por pozo si la placa tiene 24 pozos o una gota de cinco microlitros por pozo si la placa tiene 96 pozos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 10 a 15 minutos para solidificar las gotas.Mientras tanto, precale el calentamiento de un volumen adecuado de hSI-EM+Y en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de esto, agregue cuidadosamente el hSI-EM+Y precalegado a cada pozo de la placa. Incubar las células a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono.Después de dos o tres días, reemplace el medio por hSI-EM y asegúrese de actualizarlo de dos a tres veces por semana. Primero, pesa 0,2 gramos de ácido oleico líquido a temperatura ambiente. Añadir 1,5 mililitros de PBS estéril de grado de cultivo y calentar la mezcla a 70 grados Celsius durante una hora asegurándose de vórtice intermitentemente.A continuación, pesar 5,89 gramos de BSA libre de ácidos grasos y disolverlo en 33,9 mililitros de PBS. Caliente la mezcla en un baño de agua a 37 grados Centígrados hasta que la BSA esté completamente disuelta. Vórtice la mezcla de ácido oleico de nuevo para crear una emulsión de gotas finas y añadir inmediatamente a la solución BSA utilizando una pipeta de vidrio.Mantener la mezcla a 37 grados Centígrados durante 30 minutos hasta que quede una solución clara y amarillento. Pasar los organoides como se describió anteriormente y sembrar las células individuales derivadas de organoides en una placa negra de 96 pozos de fondo claro. En el sexto día de cultivo en hSI-EM, reemplace el medio de cultivo con hSI-EM que contiene un milimolar del ácido oleico y conjugado BSA.Incubar las células durante 16 a 17 horas a 37 grados celsius en presencia o ausencia de 0,1 micromolar inhibidor de DGAT1. Después de esto, aspirar el medio sin perturbar las gotas de matriz de membrana del sótano. Fije los organoides añadiendo 100 microlitros de formaldehído tamponado cuatro por ciento neutro a los pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente.Retire el formaldehído suavemente y lave cuidadosamente las células con 150 microlitros de PBS por pozo. Mancha las células para gotas de lípidos con 025 miligramos por mililitro LD540 y DAPI en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, lave los pozos cuidadosamente con PBS.Para obtener imágenes de visión general de organoides enteros, utilice un subjetivo 40X adecuado para imágenes fluorescentes confocales. Ajuste el microscopio a imagen para DAPI y el tinte LD540 utilizando los ajustes de excitación y emisión que se muestran aquí. Establezca el tamaño del agujero en una unidad venti sizey para una resolución suficiente del eje z.Para crear una imagen de la mitad de un organoide esférico, establezca una pila z en aproximadamente 85 micrómetros. Usando un sistema de procesamiento de imágenes adecuado, transforme la pila z de cada organoide a una proyección máxima haciendo clic en Imagen, Pilas, Proyecto Z. Establezca el umbral de la proyección máxima en un nivel en el que no haya señal LD540 visible en la muestra de control del vehículo BSA haciendo clic en Imagen, Ajustar, Umbral.Utilice esta configuración para umbralar cada imagen. A continuación, mida el área total de fluorescencia para cada proyección máxima utilizando la función Analizar, Analizar partículas. Para un análisis adecuado de la formación de gotas lipídicas, los organoides no deben ser sembrados demasiado densamente antes de la estimulación con ácido oleico y posterior tinción.Esto es especialmente importante para la lectura confocal y del lector de placas, ya que los organoides superpuestos podrían interferir con la fluorescencia. Después de la estimulación con un mililitro de ácido oleico durante la noche, la formación de gotas lipídicas se puede visualizar con un microscopio de campo brillante invertido. La acumulación de gotas lipídicas dispersa la luz transmitida, y por lo tanto los organoides parecen más oscuros, mientras que los organoides no estimulados tienen un aspecto translúcido.Una vez que los organoides estimulados por ácido oleico se fijan y se tiñen, la formación de gotas lipídicas se puede visualizar mediante un microscopio confocal. Como los organoides son estructuras 3D, un microscopio epifluorescente regular no es adecuado debido a la señal de fondo fuera de foco, por lo que se utiliza una pila z confocal para caracterizar LDF en organoides. La cuantificación de las muestras de microscopía confocal también se puede realizar utilizando un lector de placas fluorescentes normalizado a la señal fluorescente Hoechst.El ensayo del lector de placas indica una disminución significativa de la señal LD540 en las células organoides tratadas con inhibidor de DGAT1 en comparación con los organoides no tratados. La cuantificación de la formación de LD en células individuales se puede lograr utilizando un citometro de flujo. La estrategia de gating que se muestra aquí es para organoides intestinales humanos disociados.Los histogramas representativos tanto para la señal SSC-A como para la señal LD540 de la población final de células vivas muestran que la formación de gotas lipídicas dará lugar a un aumento de la SSC-A debido a la formación de gotas lipídicas intracelulares. Además, LD540 manchas para los lípidos que se almacenan en las gotas de lípidos, y la señal también aumentará en la inducción de la formación de gotas de lípidos. Como tal, la formación de gotas lipídicas se mide como un cambio en la intensidad fluorescente media de SSC-A y LD540.Los pasos más cruciales de este protocolo son el cultivo de organoides intestinales humanos y la corrugado adecuado de ácido oleico a BSA. Para adaptarse a más condiciones, este ensayo se puede analizar utilizando un lector de placas fluorescentes. Para corregir el número de organoide por pozo, la señal LD540 se normalizó a la señal DAPI.Con esta técnica, los investigadores pueden estudiar la formación de gotas lipídicas en sistemas organoides, y mejorar diversas técnicas de análisis como la microscopía electrónica para validar sus hallazgos.

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